微生物檢驗(yàn)規(guī)范

1、微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)1 .目的明確微生物檢驗(yàn)方法和監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn),標(biāo)準(zhǔn)微生物檢驗(yàn)的各項(xiàng)操作,通過對(duì)原料、 產(chǎn)品及生產(chǎn)線各要求環(huán)節(jié)進(jìn)行微生物測(cè)試,從檢測(cè)結(jié)果來判定原料、產(chǎn)品及生產(chǎn) 線微檢監(jiān)控點(diǎn)的微生物情況是否符合公司和國(guó)家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn),保證產(chǎn)品品質(zhì).2 .適用范圍公司所有需要作微生物檢驗(yàn)的原料、每批產(chǎn)品及微檢監(jiān)控點(diǎn).3 .責(zé)任品保微生物檢驗(yàn)員負(fù)責(zé)微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)器材和無菌室的準(zhǔn)備工作.品保微生物檢驗(yàn)員負(fù)責(zé)原料和生產(chǎn)線微檢監(jiān)控點(diǎn)的微檢樣品抽樣、保存、登記和微生物檢測(cè)工作.成品制程人員負(fù)責(zé)成品微檢樣品的抽樣工作,品保微生物檢驗(yàn)員負(fù)責(zé)成品微檢樣品的保存、登記和微生物檢測(cè)工作.品保微生物檢驗(yàn)員負(fù)責(zé)出具檢測(cè)報(bào)告并作出符合

2、性判定.品?？崎L(zhǎng)負(fù)責(zé)微生物檢測(cè)報(bào)告的審核.4 .作業(yè)程序?qū)嶒?yàn)器材4.1.1實(shí)驗(yàn)器材、培養(yǎng)基和試劑1,超凈工作臺(tái)2.恒溫培養(yǎng)箱36 ± 1C3.低溫培養(yǎng)箱 25- 28C4 ,恒溫水浴鍋46± 1C5.電子/托盤天平精確到0.1g6.高壓蒸汽殺菌鍋7.烘箱8.酒精燈9.記號(hào)筆10.打火機(jī)11.銀子12.藥匙13.生物濾膜14.9cm/6cm15.錐形瓶300ml/500ml+硅橡膠塞16 .試管17.小發(fā)酵管18.試管架19.接種環(huán)20.顯微鏡21.塑料籃子22.移液管 1ml、5ml、10ml23.膜過濾設(shè)備24.醫(yī)用/、銹鋼剪刀培養(yǎng)基和試劑1.總菌數(shù)培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)

3、基2.大腸菌群培養(yǎng)基結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂y VRBA、煌綠乳糖膽鹽BGLB3.霉菌、醉母菌培養(yǎng)基虎紅培養(yǎng)基4.氯化鈉6.乙醇7.二氧化氯粉劑8.過氧乙酸微生物檢驗(yàn)的前準(zhǔn)備檢驗(yàn)所需器具的滅菌4.2.1.1 培養(yǎng)皿及移液管的干熱滅菌潔凈枯燥的培養(yǎng)皿,倒放于專用培養(yǎng)皿鐵筒內(nèi),潔凈枯燥的移液管,尖端朝下,置于移液管專用的鐵筒內(nèi),把鐵筒放在烘箱中,于120c干熱滅菌120分鐘后,調(diào)至160- 180C干熱滅菌120分鐘后,關(guān)掉烘箱,自然冷卻至 60c以下,方可翻開烘箱門取出置無菌室冷卻備用.錐形瓶及移液管的濕熱滅菌潔凈的錐形瓶,塞上硅橡膠塞并用牛皮紙包扎好瓶口,潔凈的移液管,用牛 皮紙包扎完善后,置于蒸

4、汽滅菌鍋中,于 121c濕熱滅菌20分鐘即可.銀子、接種環(huán)等的火焰滅菌接種環(huán)、銀子要在酒精燈上須灼燒過方可使用；稀釋操作時(shí)試管口應(yīng)在火 焰上方；培養(yǎng)基容器口邊在火焰上方.化學(xué)滅菌75%酉精、100X 10-6ClO2無菌超凈臺(tái),手部及不能加熱滅菌的 PE或塑膠制品,桌子等需用化學(xué)滅菌 法；操作臺(tái)、桌子、凳子、地面在使用完后均用100X 10-6 C1O2擦洗滅菌.培養(yǎng)基及其緩沖稀釋液的配制和濕熱滅菌%生理鹽水的配制稱取2.25g氯化鈉,溶于250ml蒸儲(chǔ)水中,經(jīng)濕熱滅菌即可.4.2.2.2 75%酒精的配制取375ml無水酒精,那么需加水 375/=125m14.2.2.3 培養(yǎng)基的配制和滅菌

5、條件測(cè)定工程培喬基名稱培養(yǎng)基量/1000ml烝儲(chǔ)水殺菌條件菌落總數(shù)平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基121C X 15 分鐘大腸菌群結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂煮沸滅菌2分鐘大腸菌群煌綠乳糖膽鹽40g121C X 15 分鐘霉菌醉母虎紅培養(yǎng)埴35g121cx 20 分鐘滅菌完全后的培養(yǎng)基置于 46±1C的水浴鍋中,待培養(yǎng)基的溫度降至 46±1C方可用.濕熱滅菌的步驟：(1)檢查蒸壓釜中有否足夠的水.(2)檢查所有載有液體瓶子的螺旋蓋(或塞)是否有松動(dòng).(3)檢查各待滅菌物品是否已用牛皮紙包裹完善.(4)小心地關(guān)好殺菌釜的蓋/門.除非每個(gè)鎖都已徹底鎖緊,否那么不得加壓.(5)檢查排氣道或排氣閥是否翻開.

6、(6)加熱,使所有空氣從排氣道中隨著蒸汽自動(dòng)排出. 蒸汽要猛烈排放2-3min, 以保證蒸壓釜內(nèi)冷空氣全部排出.關(guān)閉通風(fēng)閥或排氣閥.(7)繼續(xù)加熱,至到達(dá)預(yù)定壓力及溫度.設(shè)備和培養(yǎng)基將在121c下維持20min, 以進(jìn)行滅菌.所需壓力要連續(xù)維持一定時(shí)間.(8)所需加熱時(shí)間一過,停止加熱.在排氣閥不翻開的情況下讓壓力自動(dòng)下降 到零.否那么不要翻開蒸壓釜.當(dāng)壓力為零時(shí),小心翻開排氣閥,待蒸氣排 盡后,翻開蒸壓釜蓋,讓它敞開幾分鐘以泄去多余的熱蒸汽,并將釜內(nèi)原 載有的物品充分冷卻.(9)取出釜內(nèi)原載有培養(yǎng)基或生理鹽水的瓶子,將這些瓶子存放在無菌室的傳遞箱中待之冷卻備用.滅菌完成后的培養(yǎng)基,溫度降至4

7、6± 1C方可使用.所有滅菌完成后的物品,在使用前都必須保持包裹完善無破損的狀態(tài).4.2.3無菌室及超凈臺(tái)的滅菌4.2.3.1 每天實(shí)驗(yàn)前、后把無菌室地面及超凈臺(tái)清掃干凈, 每天用100X 10-6 C1O2 消毒桌面、地面.每月用2%±氧乙酸熏蒸.4.2.3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后翻開紫外燈對(duì)無菌室空間和外表進(jìn)行殺菌1小時(shí).4.2.3.3 實(shí)驗(yàn)前,提前1小時(shí)翻開超凈臺(tái)紫外燈及無菌室紫外燈. 關(guān)掉紫外燈后, 翻開無菌室和超凈臺(tái)通風(fēng)裝置,30分鐘后,即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作.樣品的抽樣和判定標(biāo)準(zhǔn)4.3.1實(shí)驗(yàn)前應(yīng)登記樣品,給樣品編號(hào),記錄檢驗(yàn)時(shí)間、品項(xiàng)、規(guī)格、生產(chǎn)日期、 批號(hào)、檢測(cè)工程等,并

8、根據(jù)樣品數(shù)來配制培養(yǎng)基.樣品的抽樣和判定標(biāo)準(zhǔn)天然水的產(chǎn)品名,抽樣量、檢測(cè)工程、頻率、方法、標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品品項(xiàng)抽樣頻率檢胎工程檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)時(shí)間正常：1瓶/2小時(shí)/線幺喃總數(shù)濾膜法W 50 個(gè)/100ml550m1/1.25L天然水大腸菌群霉菌酵母濾膜法 濾膜法不得檢出W 20 個(gè)/100ml恒溫室放置天后隔駁開(關(guān))機(jī)：2瓶/線細(xì)菌百胸GB-4789<20 個(gè)/ml霉菌酵母_GB-4789< 5 個(gè)/ml備注：按抽樣頻率,檢驗(yàn)方法一半米用GB-4789,半采用濾膜法.生產(chǎn)線微檢監(jiān)控點(diǎn)的樣品的抽樣和判定標(biāo)準(zhǔn)各監(jiān)控點(diǎn)名,抽樣量、檢測(cè)工程、頻率、方法、標(biāo)準(zhǔn)線別監(jiān)控點(diǎn)檢驗(yàn)項(xiàng)檢驗(yàn)方標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定檢

9、驗(yàn)頻率目法水處理源水菌落總數(shù)取適宜 的稀釋 倍數(shù)做 濾膜法監(jiān)控工程1次/周大腸菌群毒菌醛母砂濾出水,碳罐出水菌落總數(shù)取適宜 的稀釋 倍數(shù)做 濾膜法監(jiān)控工程1次/維護(hù)后大腸菌群毒菌醛母精濾出水菌落總數(shù)取適宜 的稀釋 倍數(shù)做 濾膜法監(jiān)控工程1次/天大腸菌群霉菌酵母RO摸系統(tǒng)出水菌落總數(shù)濾膜法<10cfu/100ml1次/維護(hù)后大腸菌0cfu/100ml群毒菌醛母<5cfu/100ml精濾UV后出水菌落總數(shù)濾膜法<50cfu/100ml1次/天大腸菌群0cfu/100ml霉菌酵母<50cfu/100ml膜出水、膜產(chǎn)水儲(chǔ)罐、兌制水儲(chǔ)罐、兌制水UV后、菌落總數(shù)濾膜法<10c

10、fu/100ml1次/天大腸菌群0cfu/100ml霉菌酵母<5cfu/100ml氧化塔出水、洗瓶水菌落總數(shù)濾膜法<3cfu/100ml1次/天大腸菌群0cfu/100ml霉菌酵母0cfu/100ml灌裝頭開機(jī)前菌落總擦拭法<2個(gè)/每灌裝頭1次/周水線灌裝頭數(shù)霉菌酵母<5個(gè)/每灌裝頭洗瓶頭開機(jī)前<2個(gè)/每洗瓶頭洗瓶頭<5個(gè)/每灌裝頭封蓋頭< 5 個(gè)/10cm2蓋滑槽< 5 個(gè)/10cm2撥蓋星輪< 5 個(gè)/10cm2蓋貯存槽< 5 個(gè)/10cm2蓋斗< 5 個(gè)/10cm2蓋輸送帶< 5 個(gè)/10cm2洗瓶夾< 5 個(gè)

11、/10cm2門內(nèi)壁< 20 個(gè)/10cm2充填槽外壁或頂部< 20 個(gè)/10cm2風(fēng)送軌道< 20 個(gè)/10cm2輸送帶接近灌裝機(jī)< 20 個(gè)/10cm2沖洗后空瓶平均02個(gè)/瓶蠱卜滑道中蓋平均02個(gè)/蓋操作人員手部< 50個(gè)/雙手操作人員衣服2<50 個(gè)/10cm微生物檢測(cè)方法4.4.1 濾膜法：適用于進(jìn)行濾膜法檢測(cè)的各種微檢樣品.4.4.1.1 儀器：冰箱：04C；恒溫培養(yǎng)箱：36± 1C/25-28 C；恒溫水浴鍋：46±1C；電子 天平：精確至；滅菌平皿：直徑60mnl£ 90mm膜過濾設(shè)備；濾杯；pm 濾膜；超凈工作臺(tái)

12、；真 空泵；高壓滅菌鍋；滅菌的剪子、銀子、玻璃瓶及其它物品.4.4.1.2 試劑與培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基、 虎紅培養(yǎng)基、 煌綠乳糖膽鹽培養(yǎng)基,冰理鹽水,121c滅菌20min；結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂煮沸滅菌 2min； 75%L酉I; 100Ppm二氧化氯.4.4.1.3 操作步驟：(1)將樣品搖勻,取100ml倒入膜過濾裝置中,翻開抽濾泵,開始抽濾,抽干 濾液后關(guān)上抽濾泵.(2)將銀子在火焰上滅菌,膜用滅菌過的銀子取下,在火焰旁正面貼于預(yù)先制 備的培養(yǎng)基平皿中,平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基用于培養(yǎng)菌落總數(shù),虎紅瓊脂培養(yǎng) 基用于培養(yǎng)霉菌和酵母菌,VRBA培養(yǎng)基用于培養(yǎng)大腸菌群,膜下預(yù)防出現(xiàn) 氣泡.(3)培養(yǎng)

13、a.菌落總數(shù)：倒置于36± 1C的恒溫箱中,培養(yǎng) 48h土 2h.菌落總數(shù)以實(shí)際 菌數(shù)報(bào)告之,單位為 cfu/100ml或cfu/ml.b.霉菌和酵母菌：倒置于 25-28C恒溫箱中,3d后開始觀察,共培養(yǎng)觀察 5d.菌落總數(shù)以實(shí)際菌數(shù)報(bào)告之,單位為 cfu/100ml或cfu/ml.c.大腸菌群倒置于36±1C的恒溫箱中,培養(yǎng)18h-24ho取出平板,分別計(jì)數(shù)平板上 出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落.典型菌落為紫紅色,菌落周圍有紅色的 膽鹽沉淀環(huán),菌落直徑為或更大.從VRBAF板上挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落,分別移種于BGLB肉湯管內(nèi),36±1C培養(yǎng)24h4

14、8h,觀察產(chǎn)氣情況.凡BGL的湯管產(chǎn)氣, 即可報(bào)告為大腸菌群陽性.大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告：經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽性的試管比例乘以 中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù),再乘以稀釋倍數(shù),即為每100ml樣品中大腸菌群數(shù). 例：在VRBAF板上有100個(gè)典型和可疑菌落,挑取其中10個(gè)接種BGLB 肉湯管,證實(shí)有6個(gè)陽性管,那么該樣品的大腸菌群數(shù)為： 100X 6/10/100ml=60cfu/100ml .4.4.2 國(guó)標(biāo)法：適用于不能用濾膜法檢測(cè)的各種微檢樣品以及規(guī)定用國(guó)標(biāo)法檢測(cè) 的樣品.4.4.2.1 菌落總數(shù)4.4.2.設(shè)備與材料：冰箱：04C；恒溫培養(yǎng)箱：36±1C；恒溫水浴鍋：46±

15、1C；電子天平：精確 至；滅菌吸管；滅菌平皿：直徑 90mm£ 60mm超凈工作臺(tái)；高壓滅菌鍋及其它 物品.4.4.2.培養(yǎng)基與試劑：平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基, 林理鹽水,121c滅菌20min； 75%JI; 100X 10-6 ClO? 溶液.4.4.2.操作步驟：(1)樣品稀釋及培養(yǎng)a.以無菌操作取樣品.b.取樣品25 (g) ml參加到225ml滅菌生理鹽水中,經(jīng)充分混勻制成 1: 10的 樣品勻液.c.用1ml滅菌吸管吸取1:10稀釋液1ml,沿管壁徐徐注入盛有9ml滅菌生理 鹽水的試管內(nèi)(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液液面),振搖試管,混合 均勻,做成1:100的稀釋液.d.

16、另取1ml滅菌吸管,按上述操作方法,制備 10倍系列遞增稀釋樣品勻液, 如此每遞增稀釋一次,即換用1支1ml滅菌吸管.e.根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)υ嚇游廴厩闆r估計(jì),選擇2個(gè)-3個(gè)適宜稀釋度(液體樣品可包括原液),對(duì)于菌數(shù)較少的樣品,采用原倍.在進(jìn)行 10倍遞 增稀釋的同時(shí),每個(gè)稀釋度分別吸取 1ml樣品勻液參加兩個(gè)無菌平皿內(nèi),同 時(shí)分別取1ml稀釋液參加無菌平皿中彳空白對(duì)照.及時(shí)將 6-7ml或15-20ml 冷卻至46c的培養(yǎng)基傾注入平皿.采用原倍培養(yǎng)的,直接將培養(yǎng)基注入培養(yǎng) 皿中作為空白.f.待瓊脂凝固后,翻轉(zhuǎn)平板,置 36c ±1.叵溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h.(2)菌落計(jì)

17、數(shù)可用肉眼觀察,必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器.記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落 數(shù)量.菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位(CFU表示.a.選取菌落數(shù)在30-300CFU之間、無蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù). 低于 30CFU的平板記錄具體菌落數(shù),大于 300的可記錄為多不可計(jì).每個(gè)稀釋度 的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù).b.其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí),那么不宜采用,而應(yīng)以無片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；假設(shè)片狀菌落不到平板的一半,而其余一半中 菌落分布又很均勻,即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以 2,代表一個(gè)平板菌落數(shù).c.當(dāng)平板上出現(xiàn)菌藻間無明顯界線的鏈狀生長(zhǎng)時(shí), 那么將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù).3菌落總數(shù)

18、的計(jì)算方法a.假設(shè)只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi),計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù) 的平均值,再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù),作為每克或毫升中菌落總數(shù) 結(jié)果.b.假設(shè)有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí),按下式計(jì)算：N=E C/ ni+ d式中：N樣品中菌落數(shù)；EC-平板含適宜范圍菌落數(shù)的平板菌落數(shù)之和；ni 第一個(gè)適宜稀釋度平板上的菌落數(shù)；n2第二個(gè)適宜稀釋度平板上的菌落數(shù)；d稀釋因子第一稀釋度.c.假設(shè)所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于 300,那么對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù), 其他平板可記錄為多不可計(jì),結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算.d.假設(shè)所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于 30,那

19、么應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘 以稀釋倍數(shù)計(jì)算.e.假設(shè)所有稀釋度包括液體樣品原液平板均無菌落生長(zhǎng),那么以小于 1乘以最 低稀釋倍數(shù)計(jì)算.f.假設(shè)所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在 30-300之間,其中一局部小于30或大 于300時(shí),那么以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算.(4)菌落總數(shù)的報(bào)告a.菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí),按“四舍五入原那么修約,采用兩位有效數(shù)字報(bào)告.b.大于或等于100時(shí),第三位數(shù)字采用“四舍五入原那么修約,取前兩位數(shù) 字,后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示,按“四舍五入原 那么修約,采用兩位有效數(shù)字.c.假設(shè)所有平板上為蔓延菌落而無法計(jì)數(shù),那么報(bào)告菌落蔓延.

20、d.假設(shè)空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng),那么此次檢測(cè)結(jié)果無效.e.稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告,體積取樣以 CFU/m西單位報(bào)告.酵母和霉菌設(shè)備與材料：冰箱：0-4C；恒溫培養(yǎng)箱：25-28C；恒溫水浴箱：46± 1C；電子天平：精確 至 0. 1g ;滅菌具塞錐形瓶：500ml；滅菌平皿:直徑90mnm£ 60mm滅菌試管及其它滅菌設(shè) 備；4.4.2.培養(yǎng)基與試劑：虎紅培養(yǎng)基,林理鹽水,121c滅菌20min, 75%JI, 100X 10-6 ClO2溶液.4.4.2.操作步驟(1)樣品稀釋及培養(yǎng)a.以無菌操作取樣品b.取樣品25 (g) ml參加到225ml滅菌生理鹽水中,經(jīng)

21、充分混勻制成 1: 10的 樣品勻液.c.用1ml滅菌吸管吸取1:10稀釋液1ml,沿管壁徐徐注入盛有9ml滅菌生理 鹽水的試管內(nèi)(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液液面),振搖試管,混合均勻,做成1:100的稀釋液.d.另取1ml滅菌吸管,按上述操作方法,制備 10倍系列遞增稀釋樣品勻液, 如此每遞增稀釋一次,即換用1支1ml滅菌吸管.e.根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)υ嚇游廴厩闆r估計(jì),選擇2個(gè)-3個(gè)適宜稀釋度(液體樣品可包括原液),對(duì)于菌數(shù)較少的樣品,采用原倍.在進(jìn)行10倍遞 增稀釋的同時(shí),每個(gè)稀釋度分別吸取1ml樣品勻液參加兩個(gè)無菌平皿內(nèi),同 時(shí)分別取1ml稀釋液參加無菌平皿中彳空白對(duì)照.及時(shí)將

22、 6-7ml或15-20ml 冷卻至46c的培養(yǎng)基傾注入平皿.采用原倍培養(yǎng)的,直接將培養(yǎng)基注入培 養(yǎng)皿中作為空白.f.待瓊脂凝固后,翻轉(zhuǎn)平板,置于25-28C霉酵培養(yǎng)箱中.3d后開始觀察,共 培養(yǎng)觀察5d.(2)計(jì)算方法：通常選擇菌落數(shù)在10-150之間的平皿進(jìn)行計(jì)數(shù),同稀釋度的兩 個(gè)平皿的菌落平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù),即為每克(或毫升)檢樣中含霉菌和酵母數(shù),稀釋度選擇及菌落報(bào)告方式可參考菌落總數(shù)的計(jì)數(shù)方法.(3)報(bào)告：每克(或毫升)樣品中所含的霉菌和酵母菌數(shù)以cfu/g(ml)表示.4.4.2.3大腸菌群4.4.2.設(shè)備與材料：冰箱：04C；恒溫培養(yǎng)箱：36±1C；恒溫水浴鍋：46

23、77; 1C；電子天平：精確 至；滅菌吸管；滅菌平皿：直徑 90mm£ 60mm超凈工作臺(tái)；高壓滅菌鍋及其它物品.4.4.2. 培養(yǎng)基與試劑：煌綠乳糖膽鹽(BGLB, %生理鹽水,121c滅菌20min；結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂 (VRBA,煮沸滅菌2分鐘；75叱酉I; 100X 10-6 C1O2溶液.4.4.3. 操作步驟(1)樣品稀釋a.以無菌操作取樣品.b.取樣品25 (g) ml參加到225ml滅菌生理鹽水中,經(jīng)充分混勻制成 1: 10的 樣品勻液.c.用1ml滅菌吸管吸取1:10稀釋液1ml,沿管壁徐徐注入盛有9ml滅菌生理 鹽水的試管內(nèi)(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液液面

24、),振搖試管,混合均勻,做成1:100的稀釋液.d.另取1ml滅菌吸管,按上述操作方法,制備 10倍系列遞增稀釋樣品勻液, 如此每遞增稀釋一次,即換用1支1ml滅菌吸管.e.根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)υ嚇游廴厩闆r估計(jì),選擇2個(gè)-3個(gè)適宜稀釋度(液體樣品可包括原液),對(duì)于菌數(shù)較少的樣品,采用原倍.在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí),每個(gè)稀釋度分別吸取1ml樣品勻液參加兩個(gè)無菌平皿內(nèi),同 時(shí)分別取1ml稀釋液參加無菌平皿中彳空白對(duì)照.及時(shí)將 6-7ml或15-20ml 冷卻至46c的培養(yǎng)基傾注入平皿.采用原倍培養(yǎng)的,直接將培養(yǎng)基注入培 養(yǎng)皿中作為空白.(2)平板計(jì)數(shù)a.選取2個(gè)一3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度,每個(gè)稀

25、釋度接種兩個(gè)無菌平皿,每皿 1mL同時(shí)分別取1mL生理鹽水參加兩個(gè)無菌平皿作空白對(duì)照.b.及時(shí)將6-7ml或15-20ml冷至46c的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA傾注 于每個(gè)平皿中,小心旋轉(zhuǎn)平皿,將培養(yǎng)基與樣液充分混勻,待瓊脂凝固后, 再加3mL4mLVRBA蓋平板表層,翻轉(zhuǎn)平板,置于36c ±1C培養(yǎng)18h24h.(3)平板菌落的選擇選取菌落數(shù)在30150之間的平板,分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大 腸菌群菌落.典型菌落為紫紅色,菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán),菌落直徑 為或更大.(4)證實(shí)試驗(yàn)從VRBAF板上挑去10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落,分別移種與 BGLB 肉湯管內(nèi),36&

26、#177;1C培養(yǎng)18h24h,觀察產(chǎn)氣情況,凡 BGLB肉湯管產(chǎn)氣, 即可報(bào)告為大腸菌群陽性.(5)大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽性的試管比例乘以(3)中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù), 再乘以稀釋倍數(shù),即為每克(每毫升)樣品中大腸菌群數(shù).例：104樣品稀釋液1mL在VRBAP板上有100個(gè)典型和可疑菌落,挑取其中10個(gè)接種BGLB 肉湯管,證實(shí)有6個(gè)陽性管,那么該樣品的大腸菌群數(shù)為： 46 _100X 6/10X10 /g(mL)= X 10 (CFU/g)CFU/mL附：大腸菌群檢驗(yàn)程序檢樣詵擇2個(gè)3個(gè)話官稀釋序的樣品均液,將種VRBAW36c ± 1 C 18h-24h計(jì)數(shù)典

27、型和可疑菌落BGLB肉湯或復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)36 C 土 l|c 18h-24h報(bào)告4.4.3 空氣落菌檢驗(yàn)4.4.3.1 設(shè)備與材料：恒溫培養(yǎng)箱：36± 1C；霉酵培養(yǎng)箱：25C-28C；電子天平：精確至 0. 1g ;滅 菌平皿:直徑90mm高壓滅菌鍋及其它物品.4.4.3.2 培養(yǎng)基與試劑：虎紅培養(yǎng)基,平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基,121c滅菌20min.4.4.3.3 操作步驟(1)在已經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)皿中分別傾注已經(jīng)過滅菌后的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基和 虎紅培養(yǎng)基,靜置使其自然凝固.(2)將已凝固的培養(yǎng)基正向放置于需檢測(cè)空氣落菌的地點(diǎn),將培養(yǎng)皿的蓋取下,蓋口朝下,輕輕搭放在培養(yǎng)皿的邊緣.(3)將培養(yǎng)

28、皿放置30分鐘后,蓋好培養(yǎng)皿蓋取回,菌落總數(shù)平板倒放于36± 1C 恒溫箱中培養(yǎng)48h±2h,霉酵平板倒放于25-28 C低溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天.(4)計(jì)數(shù)：可用肉眼觀察,必要時(shí)用放大鏡檢查,以防遺漏.4.4.4 空氣浮游菌檢驗(yàn)4.4.4.1 設(shè)備與材料：浮游空氣塵菌采樣器；恒溫培養(yǎng)箱：36±1C；霉酵培養(yǎng)箱：25-28C,電子天平： 精確至0. 1g ;滅菌平皿:直徑90mm高壓滅菌鍋及其它物品.4.4.4.2 培養(yǎng)基與試劑：虎紅培養(yǎng)基,平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基,121c滅菌20min.操作步驟(1)在已經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)皿中分別傾注已經(jīng)過滅菌后的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基或 虎紅

29、培養(yǎng)基,靜置使其自然凝固.(2)將浮游空氣塵菌采樣器置于被測(cè)區(qū)域,翻開采樣蓋,對(duì)采樣蓋進(jìn)行擦拭消 毒,將預(yù)先制備的平皿開口置于采樣器上,蓋上采樣蓋.設(shè)置采樣的流量 為 50L.(3)采樣結(jié)束后,翻開采樣蓋取出平皿蓋好.菌落總數(shù)平板倒放于36± 1C恒溫箱中培養(yǎng)48h土2h,霉酵平板倒放于25-28C低溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天.(4)計(jì)數(shù)：可用肉眼觀察,必要時(shí)用放大鏡檢查,以防遺漏.4.4.5棉簽擦拭試驗(yàn)-外表微生物評(píng)估4.4.5.1 儀器擦拭用棉簽,理鹽水,121c滅菌20min；酒精燈；75%酉精；記號(hào)筆；其它同 菌落總數(shù)的檢測(cè)方法.4.4.5.2 培養(yǎng)基與試劑平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、虎紅培

30、養(yǎng)基4.4.5.3 操作步驟(1)將棉簽和生理鹽水121c滅菌20min.(2)手經(jīng)75%H精消毒后,或戴用酒精浸泡過的手套持棉簽的后端部擦拭；(3)擦拭：a.設(shè)備及其它平整的外表：用無菌棉簽擦拭 10cm面積的設(shè)備或其它平整 的外表,往返涂擦兩遍,每擦拭一遍,將棉簽轉(zhuǎn)動(dòng)一次.如檢測(cè)外表狹長(zhǎng), 可使其總面積到達(dá)10CR2,如所檢測(cè)外外表積較小,可適當(dāng)減少擦拭面積.b.灌裝頭或其它不規(guī)那么外表：用無菌棉簽擦拭灌裝頭外表,盡量擦拭整個(gè) 灌裝頭,往返涂擦兩遍,每擦拭一遍,將棉簽轉(zhuǎn)動(dòng)一次.c.手部：讓受試者張開手指,用無菌棉簽擦拭手指縫,然后,手指并攏, 用棉簽擦拭在五指屈面指尖至指根, 以及手掌,往返涂擦兩遍,每擦拭一遍, 將棉簽轉(zhuǎn)動(dòng)一次.嚴(yán)格遵守上述拭擦順序.(