2019年整理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化影響因素的探討

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響因素張永強(qiáng) 楊自權(quán) 衛(wèi)小春 *山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院骨關(guān)節(jié)科 030001摘要：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs ）具有成軟骨能力，但影響其向 軟骨細(xì)胞分化的因素很多，如培養(yǎng)基條件，血清，培養(yǎng)方式，傳代次 數(shù)，接種密度， 低氧，力學(xué)刺激，細(xì)胞因子，支架材料和基因修飾等。只有將這些影響因素優(yōu)化組合， 才能發(fā)揮 BMSCs 成軟骨的最大效應(yīng)。關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 軟骨細(xì)胞； 培養(yǎng)基；血清；傳代；密度； 低氧；力學(xué)刺激；細(xì)胞因子；材料；基因修飾Abstract: Bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) have

2、 the potential of differentiating into cartilage. But there are many influential factors in their chondrogenic process , such as the medium conditions, serum, culture mode, passages, inoculation density, hypoxia, mechanical stimulation, cytokine, scaffold materials, genetic modification and so on.On

3、ly optimized combination of these factors can make more bone marrow mesenchymal stem cells differentiate into chondrocytes better.Keywords: Bone marrow mesenchymal stem cells; chondrocytes;medium; serum; passages; density; hypoxia; mechanical stimulation;cytokine, scaffold ; genetic modification軟骨組織

4、工程的研究發(fā)展為關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)帶來了新的希 望。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有分化為骨、軟骨、肌腱、脂肪等組織的多 分化潛能 1，已成為理想的種子細(xì)胞之一，也是目前軟骨組織工程的研究熱點(diǎn)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在修復(fù)軟骨損傷時，無論在體內(nèi)體外，都必須經(jīng)歷向軟骨細(xì)胞分化的過程，在此過程中有著諸多影響因素， 目前在這方面的研究亦較多。 現(xiàn)將影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞 分化的多方面因素進(jìn)行綜述。1 細(xì)胞培養(yǎng)1.1 分離方法從骨髓中分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法主要有貼壁法 、密度梯度 離心法 、免疫磁珠或流式細(xì)胞儀分離法 2。前兩者因?yàn)楹唵斡行詰?yīng)用較多。 Wang 等3 應(yīng)用貼壁法和密度梯度離心法分別培養(yǎng)B

5、MSCs,并在同種條件下向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，最后用免疫組織化學(xué)染色和原位雜交法鑒定兩組n型膠原及n型膠原mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示兩種方法分離的 BMSCs 均能成功的誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞且無明 顯差別。但有研究表明：通過貼壁法培養(yǎng)的細(xì)胞在純度、活性、生物 學(xué)形態(tài)和特征、增殖傳代能力方面更優(yōu)于密度梯度離心法 4-51.2 培養(yǎng)基a-MEM 、DMEM-LG 、DMEM-HG 、DMEM 、DMEM-F12 是目前在 BMSCs培養(yǎng)過程中應(yīng)用較多的培養(yǎng)基。絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用DMEM-LG培養(yǎng)基進(jìn)行 BMSCs 的分離與擴(kuò)增 ，少數(shù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用DMEM-F12、a-MEM 、DMEM 、DMEM-HG 進(jìn)行

6、，因?yàn)榈吞菞l件比 高糖條件 更利于 BMSCs 的增殖6。但 Majumdar 等7 比較了DMEM-LG ，a-MEM 培養(yǎng)基對間充質(zhì)干細(xì)胞生長的影響， 認(rèn)為 a-MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞較 DMEM-LG 具有更高的集落形成率和促增殖作用。然而，Coelho等【8卻發(fā)現(xiàn)a-MEM和DMEM-HG對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力沒有明顯的影響。大多實(shí)驗(yàn)室用 DMED-HG 構(gòu)成的完 全誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo) BMSCs 成軟骨分化。目前，國內(nèi)外有關(guān)培養(yǎng)基對BMSCs 向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化影響的研究較少，還需進(jìn)一步探討。1.3 血清雖然無血清培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)中也有所應(yīng)用，但因其添加的成分 價(jià)格昂貴，體外培養(yǎng)操作

7、復(fù)雜，不利于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，而在應(yīng)用 上受到了限制，所以血清在細(xì)胞培養(yǎng)過程中顯得至關(guān)重要。 Shahdadfar等9研究表明：自體血清和胎牛血清都有利于人 BMSCs 增殖，胎牛 血清更佳，兩種血清對人 BMSCs 的形態(tài)和表型均無影響，但在分化 水平上自體血清不如胎牛血清。 同種異體人血清不利于 BMSCs 增殖， 而且會導(dǎo)致細(xì)胞生長停滯以及死亡。 劉一天等 10用含有不同濃度胎牛血清的誘導(dǎo)液對 BMSCs 向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，結(jié)果表明濃度為 10%的胎牛血清有利于 BMSCs 向軟骨細(xì)胞分化。血清中除了含有已知的 白蛋白、脂類、維生素、糖類等物質(zhì)外，血清中還含有一千余種未知 的化學(xué)成分，

8、這些已知和未知的血清成分均有可能對 BMSCs 的成軟 骨分化和組織形成產(chǎn)生重要的影響 11。但具體是哪些成分對 BMSCs向軟骨細(xì)胞分化有促進(jìn)作用及其具體機(jī)制如何，這些問題還有待研 究。1.4 培養(yǎng)方法目前，很多實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng) BMSCs 都是應(yīng)用平面培養(yǎng)瓶二維靜態(tài)培 養(yǎng)，但研究表明在促進(jìn) BMSCs 向軟骨細(xì)胞分化方面三維培養(yǎng)環(huán)境優(yōu) 于二維環(huán)境，動態(tài)培養(yǎng)優(yōu)于靜態(tài)培養(yǎng)12-13。Johnstone等14于1998年首先提出了三維培養(yǎng)體系，將 BMSCs 制成高密度細(xì)胞微球，在這種 三維培養(yǎng)體系中，成功地使 BMSCs 分化為軟骨細(xì)胞。 PITTENGER等15通過離心使BMSCs形成小的團(tuán)狀沉淀

9、，然后靜置培養(yǎng)，10-14 d后，細(xì)胞形態(tài)由梭形變?yōu)榉蚀筌浌羌?xì)胞狀， 表達(dá)軟骨細(xì)胞的特異分子 標(biāo)記物n型膠原及胞外基質(zhì)中蛋白聚糖豐富。 并且，隨著培養(yǎng)時間的 推移，具有軟骨細(xì)胞分子標(biāo)記物的細(xì)胞數(shù)量越來越多。培養(yǎng) 3 個月， 通過組織學(xué)觀察可見軟骨細(xì)胞樣陷凹。 將三維支架材料與細(xì)胞復(fù)合培 養(yǎng)也是給細(xì)胞提供一個三維培養(yǎng)環(huán)境。 三維培養(yǎng)環(huán)境將細(xì)胞外基質(zhì)良 好的固定與細(xì)胞周圍， 有利于細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)揮對細(xì)胞增殖分化及代謝 的調(diào)節(jié)作用 16。動態(tài)培養(yǎng)采用生物反應(yīng)器， 目前應(yīng)用較多的生物反應(yīng) 器主要為微重力旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器和流體灌注式生物反應(yīng)器。 微重力旋 轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器是模擬細(xì)胞生存的體內(nèi)微重力環(huán)境， 使細(xì)胞

10、承受較低的 剪切力，提高細(xì)胞內(nèi)外、細(xì)胞間物質(zhì)傳遞效率，從而提高細(xì)胞分化質(zhì) 量17。王會才等 12研究表明：微重力條件下動態(tài)誘導(dǎo) BMSCs 細(xì)胞外 基質(zhì)成分膠原和蛋白多糖產(chǎn)量均高于非微重力組， 三維動態(tài)培養(yǎng)組效 果最佳，提高了軟骨細(xì)胞分化的質(zhì)量和效率。 流體灌注式生物反應(yīng)器是模擬軟骨細(xì)胞在體內(nèi)的間歇性生理液態(tài)壓力條件。Carver等18 發(fā)現(xiàn)在間歇性生理液態(tài)壓力下，于 PGA 網(wǎng)上培養(yǎng) 5 周的馬的軟骨細(xì)胞， 可明顯促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成， 其糖胺多糖的含量至少是無壓力培養(yǎng) 組的兩倍，并與液態(tài)壓力的壓縮模量有量效關(guān)系。1.5 傳代次數(shù)目前，國內(nèi)外有關(guān)傳代對 BMSCs 向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化影響的研

11、究尚少。Banfi19等研究表明BMSCs在傳至第4代時成軟骨能力即開 始降低，24 次倍增后成軟骨能力喪失。 但胡靜波等 20表明將人 BMSCs進(jìn)行 24 次倍增后倍增能力喪失，但成軟骨能力人保留。霍建忠等 21將不同代 BMSCs 經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)后， RT-PCR 檢測蛋白多糖 mRNA表達(dá)及甲苯胺藍(lán)染色，結(jié)果顯示第 6代后 BMSCs 成軟骨能力減弱。建議 BMSCs 作為軟骨組織工程種子細(xì)胞應(yīng)選擇第 3、4、5 代行成軟 骨誘導(dǎo)。1.6 細(xì)胞接種密度胚胎發(fā)育過程中體內(nèi)軟骨形成的最早形態(tài)學(xué)變化是間充質(zhì)細(xì)胞間 距縮小，細(xì)胞與細(xì)胞之間形成緊密接觸狀 22。細(xì)胞局部聚集是軟骨形態(tài)發(fā)生前的重要步

12、驟。 這種細(xì)胞的局部聚集被認(rèn)為是由細(xì)胞與細(xì)胞之 間的粘附分子或細(xì)胞外基質(zhì)成分如纖維粘連蛋白，層粘連蛋白所介 導(dǎo)，并可以被細(xì)胞間粘附分子鈣粘素所加強(qiáng) 23。上文提到的能誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞的細(xì)胞微球和離心沉淀形成的細(xì)胞團(tuán)都是給 BMSCs 生 長提供一個高密度三維生長環(huán)境， 這種環(huán)境有利于細(xì)胞與細(xì)胞之間及 細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的信號傳遞， 類似于胚胎發(fā)育過程中軟骨形態(tài) 發(fā)生前間充質(zhì)細(xì)胞聚集。研究表明，接種密度大于1X 106/cm2能促進(jìn) BMSCs 分化為軟骨細(xì)胞，而且能使細(xì)胞外基質(zhì)在一定時間內(nèi)迅速 形成24。 Ponticiello【25等將人BMSCs以不同密度接種于明膠海綿，在含 TGF-

13、 ?3 的化學(xué)限定培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 結(jié)果表明細(xì)胞的接種密度影響 細(xì)胞產(chǎn)生糖胺多糖和n型膠原的能力，以12X 106個/ml的密度最為有效。2物理因素 2.1 低氧環(huán)境大 量研 究表 明低氧環(huán)境有利 于 BMSCs 向 軟骨 細(xì) 胞 分化 。MOUSSAVI-HARAMI 等26 通過觀察體積分?jǐn)?shù) 0 .21、0.05 兩種氧分 壓下的軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)， 在體積分?jǐn)?shù) 0 .21氧分壓下的軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖受到嚴(yán)重的削弱， 并且氧化產(chǎn) 物大量堆積。Ohnishi等27研究發(fā)現(xiàn)低氧促進(jìn)了 BMSCs增殖因子的基因表達(dá)，如結(jié)締組織生長因子、 成纖維細(xì)胞生長因子 7、血小板源性生

14、長因子A。而且發(fā)現(xiàn)在短時間內(nèi)這些因子表達(dá)水平與低氧培養(yǎng)時 間成正相關(guān)。Robi ns等28研究表明，低氧條件下培養(yǎng) BMSCs，軟骨細(xì)胞標(biāo)記物Sox-9基因表達(dá)明顯增加，說明低氧促進(jìn) BMSCs向軟骨細(xì)胞分化。 Martin-Rendon 等29在低氧條件下培養(yǎng) BMSCs 24 小時后 發(fā)現(xiàn)短時間的低氧環(huán)境有利于 BMSCs的增殖和向軟骨分化。Grayson等30將 BMSCs 在三維環(huán)境下進(jìn)行長時間低氧培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)體積分?jǐn)?shù)為2%的低氧刺激能增強(qiáng)BMSCs的增殖和向軟骨細(xì)胞分化。關(guān)節(jié)腔內(nèi)環(huán)境是一種低氧的環(huán)境，在體外低氧環(huán)境下誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMSCs能向軟骨細(xì)胞分化，可能正是因?yàn)檫@種低氧環(huán)境近似于關(guān)

15、節(jié)腔環(huán)境。2.2 力學(xué)刺激研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)牧W(xué)刺激對BMSCs向軟骨細(xì)胞分化有一定的積 極作用。上文也提到生物反應(yīng)器產(chǎn)生的微重力環(huán)境和流體灌注壓能促 進(jìn) BMSCs 分化為軟骨細(xì)胞。劉天一等 31將豬 BMSCs 在離心機(jī)中培 養(yǎng)，2次/天，每次30min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)微重力能誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化，并形成軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)。呂昌偉等 32 將 BMSCs 放置在 12rmin 的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)微重力能夠顯著促進(jìn)成軟骨分 化，同時也提高了 II 型膠原以及蛋白多糖等軟骨特異性基質(zhì)的沉積。Angele等33在循環(huán)流體靜壓力刺激條件下培養(yǎng) BMSCs, 2w和4w后發(fā)現(xiàn)，蛋白多糖和 II

16、 型膠原在基因水平和蛋白質(zhì)水平上都顯著提高， 表明細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。并應(yīng)用單純的力學(xué)刺激誘導(dǎo)部分 BMSCs分化為軟骨細(xì)胞。證明了單一的力學(xué)因素可以促進(jìn) BMSCs 向軟骨細(xì) 胞分化。Mouw等34研究表明力學(xué)刺激可以促進(jìn) TGF-?1的信號傳導(dǎo),而 TGF-?1 能提高 BMSCs 對力學(xué)刺激的敏感性，進(jìn)而促進(jìn)成軟骨分 化。雖然單一的力學(xué)刺激能誘導(dǎo)部分 BMSCs 成軟骨分化，但力學(xué)刺 激與轉(zhuǎn)化生長因子等協(xié)同作用能更好地促進(jìn) BMSCs 分化為軟骨細(xì) 胞。3支架材料和細(xì)胞因子組織工程的三大要素即：種子細(xì)胞，支架材料和細(xì)胞因子。在以BMSCs 為種子細(xì)胞的軟骨組織工程中， 選擇對 BMSCs

17、 生長增殖及向 軟骨細(xì)胞分化有積極作用的的支架材料和細(xì)胞因子非常重要。3.1 細(xì)胞因子目前研究最多的促進(jìn) BMSC 成軟骨分化的細(xì)胞因子主要有轉(zhuǎn)化 生長因子-?（TGF-?）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）、堿性成纖維細(xì)胞生 長因子（b-FGF）和胰島素樣生長因子（IGF）等。TGF-?是一族具有 多種功 能的 多肽 ,可 以 調(diào) 節(jié)多種 細(xì) 胞 的 增殖 和 分 化。 1998 年JOHNSTONE 等35率先在體外誘導(dǎo)成年哺乳動物 BMSCs 分化生成軟骨獲得成功，證明了 TGF-?1 具有促 BMSCs 成軟骨能力。 BARRY等 36通過 TGF-?2 和 TGF-?3 也成功誘導(dǎo) BMSC

18、s 分化為軟骨細(xì)胞。BMP 屬于 TGF-? 超家族成員，至今已有 40多種 BMP 被成功地分離。Sekiya等37研究發(fā)現(xiàn)BMP-2、BMP-4和BMP-6均可誘導(dǎo)人BMSCs向軟骨細(xì)胞方向分化，其中 BMP-2 成軟骨表達(dá)比效率更高。 TGF 超 家族內(nèi)不同因子間有協(xié)同作用，在誘導(dǎo) BMSCs 成軟骨分化時，單一 因子不如多因子聯(lián)合誘導(dǎo)。 成纖維生長因子是關(guān)節(jié)軟骨中一種重要的 自分泌生長因子，在 BMSCs 表面表達(dá)有成纖維細(xì)胞生長因子受體。b-FGF 是成纖維生長因子的一種，有促進(jìn) BMSCs 成軟骨分化作用。TSUTSUMI等38在培養(yǎng)基中加入b-FGF對BMSCs進(jìn)行擴(kuò)增，隨后行微

19、球培養(yǎng)， 4d 后，微球表面出現(xiàn)球形軟骨細(xì)胞，并被軟骨特征性的 蛋白多糖圍繞，結(jié)果明顯優(yōu)于對照組。IGF包括IGF-1和IGF-2 °IGF-1是最早確認(rèn)的對關(guān)節(jié)軟骨具有自分泌調(diào)節(jié)作用的生長因子?？纱龠M(jìn)BMSCs 向軟骨細(xì)胞分化， 有利于軟骨生長。 不同物種的 BMSCs 向軟 骨分化需要不同的生長因子。 不同的生長因子在誘導(dǎo)分化中有著協(xié)同 作用。如何更好的讓細(xì)胞因子在誘導(dǎo) BMSCs 向軟骨細(xì)胞分化中發(fā)揮 積極作用還有待研究。3.2 支架材料在以 BMSCs 為種子細(xì)胞的軟骨組織工程中，良好的支架材料不僅 要有良好的生物相容性；良好的空隙結(jié)構(gòu)；良好的降解率；有利于細(xì) 胞貼附生長；

20、無細(xì)胞毒性等特點(diǎn)外， 還必需使細(xì)胞和材料復(fù)合后能成 功地向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化。 目前軟骨組織工程支架材料種類繁多， 主 要可分為三類：天然高分子支架材料，如藻酸鹽、殼聚糖、膠原等;人工合成材料，如聚乙二醇(PEG)、多肽、聚乳酸(LA)、聚羥基乙 酸(PGA)等；復(fù)合材料，如膠原/殼聚糖、聚氧化乙烯/甲殼素/ 殼聚糖、殼聚糖明膠等。多數(shù)支架材料都具有較好的三維結(jié)構(gòu)，這 種三維結(jié)構(gòu)為 BMSCs 提供的三維生長環(huán)境有利于細(xì)胞成軟骨分化。Diduch 等39 將 MSCs 與不同材料復(fù)合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在瓊脂糖中培養(yǎng)的MSCs 的 II 型膠原、蛋白多糖含量增長最快，藻酸鹽次之；膠原凝膠 隨培養(yǎng)時間延長會發(fā)生體積回縮，而藻酸鹽不僅能促進(jìn) MSCs 成軟 骨，而且長期培養(yǎng)中體積不會發(fā)生變化。 王覓格等 40將 MSCs、 TGF-?1與多孔三維立體結(jié)構(gòu)的 PLLA/ 明膠復(fù)合 , 在動物體內(nèi)成功構(gòu)建組織 工程軟骨組織。大量研究表明，多種支架材料和 BMSCs 復(fù)合后都能 成功誘導(dǎo)為軟骨細(xì)胞。 其原因除了與材料的三維結(jié)構(gòu)有關(guān)外， 還可能 與材料成分等其他因素也有關(guān)系。4 基因修飾多種細(xì)胞因子有促進(jìn) BMSCs 成軟骨分化作用。但是外源性生長 因子半衰期較短， 需要較大劑量或連續(xù)給藥才能對細(xì)胞產(chǎn)生持續(xù)性誘 導(dǎo)刺激作用。