南方醫(yī)科大學(xué)微生物試驗(yàn)報(bào)告

1、2016年南方醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告 日期2016年5月22號(hào) 題目 膿汁和典便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè) 成績(jī) 實(shí)驗(yàn)者 作者：馬浩楠 3140020007 參與者名字： 馬浩楠丁超王堯鑫桂義茁 年級(jí)專(zhuān)業(yè) 2014級(jí)醫(yī)學(xué)影像專(zhuān)業(yè) 指導(dǎo)老師 羅軍 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1 1、掌握培養(yǎng)基制備的原則和一般方法。 2 2、掌握病原菌的分離與培養(yǎng)方法。 3 3、掌握油鏡的正確使用、細(xì)菌涂片標(biāo)本的制備、革蘭氏染色法，熟悉細(xì)菌基本形態(tài)。 4 4、熟悉幾種常用的細(xì)菌生化反應(yīng)的名稱(chēng)、原理、方法、結(jié)果分析及用途。 5 5、掌握血漿凝固酶試驗(yàn)的原理、方法及用途。 6 6、熟悉藥物敏感性試驗(yàn)方法的種類(lèi)、原理及應(yīng)用，掌握紙片擴(kuò)

2、散法。 7 7、掌握玻片凝集試驗(yàn)的原理、方法、結(jié)果觀察與判斷。 二、實(shí)驗(yàn)器材 1 1、天平、稱(chēng)量紙、干粉培養(yǎng)基、錐形瓶、量筒、1515 支試管、試管架、試管筐、 5ml5ml 刻度吸管、平皿、洗耳球、酒精燈 2 2、膿汁標(biāo)本 1 1 支，糞便標(biāo)本 1 1 支；伊紅美蘭平板 2 2 個(gè)，營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板 2 2 個(gè)，伊紅美藍(lán)平板 2 2 個(gè)，接種環(huán)，酒精燈 3 3、斜面 4 4 支、細(xì)菌分離培養(yǎng)物（上次實(shí)驗(yàn)平板） 4 4、斜面培養(yǎng)物 4 4 支，營(yíng)養(yǎng)肉湯 4 4 支，生理鹽水 2 2 支，鏡油瓶、拭鏡紙 1 1 套，吸水紙 1 1 本，載玻片 4 4 張，染色瓶，染色架 5 5、斜面培養(yǎng)物 4 4

3、支，營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物(菌液)4 4 支，半固體瓊脂 4 4 支，營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板 4 4 個(gè)，糖發(fā)酵管 1 1 套，抗菌素紙片 1 1 套，眼科銀子 2 2 把 6 6、半固體培養(yǎng)物 4 4 支，藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)物 4 4 個(gè)，微量發(fā)酵管培養(yǎng)物 1 1 套。 三、方法與步驟 1 1、培養(yǎng)基的制備: 稱(chēng)量干粉培 養(yǎng)基(g)(g) 水量(ml)(ml) 煮沸(次) 分裝(ml)(ml) 備注 營(yíng)養(yǎng)瓊脂 11.411.4 300300 3 3 瓶,500ml500ml 瓶，平板 營(yíng)養(yǎng)瓊脂 2.72.7 7070 3 3 5 5 1414 支 X3,X3,中試管，斜面 營(yíng)養(yǎng)肉湯 1.31.3 6060 1 1

4、3 3 2020 支 X2,X2,小試管，肉湯 半固體瓊脂 1.71.7 6060 3 3 4 4 1414 支 X3,X3,小 試管，高層 (1)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的制備：稱(chēng)量11.4g瓊脂，置于三角燒瓶中，加入300ml蒸儲(chǔ)水，分2瓶裝，用于倒平板。 (2)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的制備(用于制作斜面)：稱(chēng)量2.9g瓊脂，置于三角燒瓶中，加入 75ml蒸儲(chǔ)水，放在電爐上，先后煮沸3次，分15支中試管裝，每支試管5ml。 (3)肉湯培養(yǎng)基的制備(用于制作液體培養(yǎng)基)：稱(chēng)量1.1g瓊脂，置于三角燒瓶中，加 入50ml蒸儲(chǔ)水，放在電爐上，煮沸1次，分15支小試管裝，每支試管5ml。 (4)半固體瓊脂培養(yǎng)基的制

5、備：稱(chēng)量1.7g瓊脂，置于三角燒瓶中，加入60ml蒸儲(chǔ)水，放 在電爐上，先后煮沸3次，分15支中試管裝，每支試管4ml。 2 2、細(xì)菌的分離培養(yǎng) 平板劃線(xiàn)分離法 甲 f f 膿汁標(biāo)本-營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板（黃色）乙-膿汁標(biāo)本-營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板（黃色）內(nèi)一糞便標(biāo)本一伊紅美藍(lán)平板（紫色）丁一糞便標(biāo)本一伊紅美藍(lán)平板（紫色）步驟：接種環(huán)燒灼滅菌。取標(biāo)本 3 36ul6ul。平板采光，當(dāng)看到平板表面象鏡面有反光的時(shí)候，保持這個(gè)角度，劃線(xiàn)時(shí)就能看清劃線(xiàn)痕跡，以便控制劃線(xiàn)。 接種環(huán)與平板呈 30304040 度角，在平板表面上方，以曲線(xiàn)的形式，作大幅度來(lái)回連續(xù)劃線(xiàn)，邊劃邊退，線(xiàn)段要?jiǎng)澋瞄L(zhǎng)而密集，每區(qū)劃線(xiàn)不少于 3030

6、 條。燒掉 接種環(huán)上多余的標(biāo)本。轉(zhuǎn)動(dòng)平板，通過(guò)第一區(qū) 5 57 7 次，使接種環(huán)重新沾上少 量細(xì)菌，同樣的方法劃第二區(qū)。轉(zhuǎn)動(dòng)平板，接種環(huán)通過(guò)第二區(qū) 1 1 次，劃第三區(qū)。轉(zhuǎn)動(dòng)平板，接種環(huán)通過(guò)第三區(qū) 1 1 次，劃第四區(qū)。劃第五區(qū)。 3 3、細(xì)菌的純培養(yǎng) 斜面接種分工 甲 f f 普通平板黃色菌落-1 1 支斜面乙普通平板白色菌落1 1 支斜面 內(nèi)-EMWEMW 板-紫黑菌落-1 1 支斜面丁-EMBEMB 平板-粉紅菌落-1 1 支斜面 方法：接種環(huán)套住菌落輕刮取菌-接種環(huán)取菌后，伸入斜面底部，自下向上 先拉條細(xì)菌接種線(xiàn)-再伸入底部，自下向上，作蜿蜒劃線(xiàn)-細(xì)菌涂布接種在斜面培養(yǎng)基的表面斜面正面

7、上 2/32/3 作標(biāo)記：組號(hào)、顏色收集平板-滅菌桶內(nèi) （平板底部朝下，蓋朝上放置）速送滅菌室-高壓蒸汽滅菌-洗刷。 4 4、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查 涂片干燥固定染色 （1 1）涂片-干燥-固定 甲 f f 黃色，紫黑。乙-白色，粉紅。 丙-黃色，紫黑。丁-白色，粉紅。 方法：涂片：接種環(huán)取鹽水 3ulX23ulX2 滴，水滴間距小于 2cm;2cm;取菌苔少許（1mm1mm 小菌落半個(gè)）與鹽水混勻，涂成大于 lcm2;lcm2;涂畢環(huán)移至涂膜中央側(cè)立，待環(huán)內(nèi)菌膜破裂，接種環(huán)燒灼滅菌。-干燥固定：手持載玻片-端，涂膜朝上，兩個(gè)涂膜快速通過(guò)火焰外層 3 3 次，時(shí)間 2?32?3 秒鐘。 革蘭染色 涂

8、片-干燥-固定-結(jié)晶紫-初染 1 1 分鐘-水洗-盧戈碘液-媒染 1 1 分鐘-水洗95%95%乙醇月色約 2020秒鐘一 7 7 尺洗一稀釋品紅一復(fù)染 1 1 分鐘一水洗一吸干， 鏡檢。 油鏡使用方法： 10X10X 物鏡一看清標(biāo)本一滴加香柏油一 100X100X 油鏡一浸泡油中模糊物象-細(xì)調(diào)節(jié)調(diào)焦，觀察物像-記錄結(jié)果-關(guān)閉電源-擦鏡紙拭去香柏油一 擦鏡紙沾少許乙醇和乙醴（7:37:3）混合液擦拭-擦鏡紙擦拭油鏡。 5 5、液體培養(yǎng)基接種（肉湯接種）甲 f f 金黃色，乙-白色，丙-紫黑，丁-粉紅。 方法：（1 1）接種環(huán)斜面取菌，在靠近液面的管壁上，上下研磨接種；（2 2）在管壁上，將接種

9、環(huán)內(nèi)的菌膜拍破。退出接種環(huán)，燒灼滅菌；（3 3）標(biāo)記：組號(hào)，顏色 6 6、細(xì)菌的生化試驗(yàn)等 （1 1）細(xì)菌的糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)： 在紫黑色的斜面培養(yǎng)基取適量菌落接種在含有葡萄糖的發(fā)酵管中，并做好 標(biāo)記 在紫黑色的斜面培養(yǎng)基取適量菌落接種在含有乳糖的發(fā)酵管中，并做好標(biāo) 記 在粉紅色的斜面培養(yǎng)基取適量菌落接種在含有葡萄糖的發(fā)酵管中，并做好 標(biāo)記 在粉紅色的斜面培養(yǎng)基取適量菌落接種在含有乳糖的發(fā)酵管中，并做好標(biāo) 記 步驟：用砂輪在糖發(fā)酵管液面上方 2 23cm3cm 處，切割一道切痕。兩手握住發(fā)酵管將管子折斷。管口燒灼滅菌。接種針斜面取菌，伸入培養(yǎng)基內(nèi)，在管壁上，上下研磨接種。退出接種針，燒灼滅菌。管口朝向

10、相同，放置在平皿內(nèi)。 （2 2）抗菌素敏感性試驗(yàn) 紙片擴(kuò)散法 甲 f f 黃色菌液乙-白色菌液 丙-紫黑菌液丁-粉紅菌液 方法： 先取-環(huán)菌液； 沿平板直徑拉一條細(xì)菌接種線(xiàn)； 再取一環(huán)菌液； 旋轉(zhuǎn)平板 9090 度角，拉另一條接種線(xiàn)， 使兩條細(xì)菌接種線(xiàn)呈“十字形”； 然后在平板上半部， 作連續(xù)來(lái)回密集劃線(xiàn)，每次劃二分之一平板；旋轉(zhuǎn)平板 9090 度角， 二次密集劃線(xiàn)；旋轉(zhuǎn)平板 9090 度角， 三次密集劃線(xiàn)；旋轉(zhuǎn)平板 9090 度角， 四次密集劃線(xiàn)；設(shè)三點(diǎn)，呈等邊三角距離；點(diǎn)距離平板邊緣約 15mm;15mm; ?作標(biāo)記：青、先、慶；？銀子尖嘴朝下，夾取相應(yīng)藥物紙片的邊緣，平貼在已設(shè)定的位置上

11、，輕輕按壓紙片。 (3)(3)血漿凝固酶試驗(yàn) 步驟： 取二滴兔血漿置于潔凈的玻片上。 分別用接種環(huán)取白色和金黃色菌苔(約 2 23 3 個(gè)菌落的菌量)與血漿研磨混合成直徑 8 810mm10mm 勺一層薄菌膜。立即觀察結(jié)果。 (4)(4)半固體穿刺接種法 用接種針取紫黑色菌落垂直刺入半固體培養(yǎng)基，再按原路返回，并做好標(biāo)記 用接種針取粉紅色菌落垂直刺入半固體培養(yǎng)基，再按原路返回，并做好標(biāo) 記 步驟：接種針斜面取菌，從半固體中心，垂直刺入，到達(dá)培養(yǎng)基底部 5 5 分之 4 4 處，再循原來(lái)的路線(xiàn)，退出接種針。管口、接種針經(jīng)火焰燒灼滅菌37c37c 下培養(yǎng) 18241824 小時(shí)。 7 7、細(xì)菌的血

12、清學(xué)試驗(yàn)、結(jié)果分析 玻片凝集試驗(yàn) 取潔凈的載玻片一張，將磨面近端設(shè)為對(duì)照區(qū)，滴加生理鹽水 15ul15ul。遠(yuǎn) 端設(shè)為試驗(yàn)區(qū)，滴加福氏志賀菌診斷血清 15ul15ul, , 用接種環(huán)分別取粉紅色菌苔，約 2 2 個(gè)小菌落的菌量，研磨于鹽水或血清內(nèi)，混合均勻。 載玻片來(lái)回傾側(cè)，讓菌液充分混勻，凝集速度更快、結(jié)果更清楚。 觀察記錄結(jié)果：菌液凝集者記為陽(yáng)性，菌液均勻混濁記為陰性。 四、結(jié)果與討論 (一)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1 1 . .洗手前后對(duì)比 圖片分析：洗手圖不是很理想，上面同學(xué)的洗手后與消毒后與預(yù)期的不一致，可能是操作不當(dāng)引起的。 2 2 . .細(xì)菌的分離培養(yǎng)結(jié)果： (1)(1)膿汁標(biāo)本在普通平板上有

13、黃色、白色兩種菌落，菌落的色素是脂溶性的，是細(xì)菌本身的顏色。菌落直徑 2mn2mn右、圓形、隆起、表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊、不透明。 (2(2)糞便標(biāo)本在伊紅美藍(lán)平板上，有紫黑色、淡粉紅色兩種菌落，菌落色素是水溶性的，不是細(xì)菌本身的顏色，紫黑色菌落具有金屬光澤、大而隆起、不透明的菌落，菌落直徑 2?2?3mm3mm 粉紅色菌落淡粉紅色，半透明，直徑 1?1?2mm.2mm. 圖片分析：由于同學(xué)都是第一次劃線(xiàn)，所以劃線(xiàn)都不是很好。 3 3 .細(xì)菌的純培養(yǎng)： 在斜面培養(yǎng)基上得到四種菌體的純培養(yǎng)標(biāo)本，從普通平板上挑取的黃色或白色 菌落接種的斜面，菌苔的顏色，還是原來(lái)菌落的顏色，黃色或白色。 從伊紅美

14、藍(lán)平板上挑取的紫黑色或粉紅色菌落接種的斜面，菌苔已經(jīng)沒(méi)有原來(lái)菌 落的顏色。菌苔灰白色、表面濕潤(rùn)、光滑、前者不透明，后者透明 圖片分析：中間兩組效果不好，可能來(lái)自于采菌過(guò)少或者劃線(xiàn)操作不當(dāng) 4,4,細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查 膿汁標(biāo)本（左邊為白色菌苔，右圖為金黃色菌苔） 糞便標(biāo)本(左圖為粉紅菌苔，右圖為紫黑色菌苔) 鏡下觀察：用普通平板，從濃汁標(biāo)本中分離得到黃色、白色兩種菌落，這兩株細(xì)菌，顯微鏡油鏡下均為 G+G+求菌，排列不規(guī)則，呈葡萄用狀，是典型的葡萄球菌。結(jié)合菌落色素，這兩株葡萄球菌可能是金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌。 用伊紅美藍(lán)平板，從糞便標(biāo)本分離、獲得紫黑色和粉紅色半透明兩種菌落。紫黑色菌落可能

15、是能分解乳糖的非致病菌大腸埃希菌。粉紅色菌落是不能分解乳糖的致病菌。顯微鏡下，均為 G G- -桿菌，散在排列，從形態(tài)上不能鑒別是什么細(xì)菌。 6.6.細(xì)菌的生化試驗(yàn)等： (1)(1)半固體穿刺接種法 圖片分析：實(shí)驗(yàn)效果與預(yù)期一致，但是拍攝效果不是很好 四組的半固體培養(yǎng)接種的培養(yǎng)圖，由于拍攝效果不好，但是依然可以分辨生長(zhǎng)的情況。 直線(xiàn)生長(zhǎng)的表明無(wú)鞭毛。 細(xì)菌的糖發(fā)酵試驗(yàn) 糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖.從下至上分別為: (粉紅一乳糖粉紅一葡萄糖紫黑一乳糖紫黑一葡萄糖) 編號(hào) 菌苔 糖發(fā)酵管 反應(yīng)現(xiàn)象 結(jié)果描述 符號(hào) 甲 紫黑 糖發(fā)酵管變 黃色有氣泡 分解 X X 糖產(chǎn) 酸又產(chǎn)氣 乙 紫黑 糖發(fā)酵管變 黃色有氣

16、泡 分解 X X 糖產(chǎn) 酸又產(chǎn)氣 丙 粉紅 糖發(fā)酵管變 黃色無(wú)氣泡 分解 X X 糖產(chǎn) 酸/、產(chǎn)氣 + + 丁 粉紅 糖發(fā)酵管變 紫色無(wú)氣泡 分解 X X 糖產(chǎn) 酸/、產(chǎn)氣 - - +:產(chǎn)酸或陽(yáng)性：產(chǎn)酸產(chǎn)氣- -:陰性 紫黑細(xì)菌微型發(fā)酵關(guān)內(nèi)液體變黃，產(chǎn)生氣泡，氣泡的高度分別為 10mnf10mnf 口 17mm17mm 說(shuō)明紫黑色菌苔既分解葡萄糖也分解乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；粉紅細(xì)菌只分解葡萄糖，不產(chǎn)氣，不分解乳糖。 (3)(3)抗菌素敏感試驗(yàn)結(jié)果 圖片分析：.3.3 號(hào)同學(xué)劃線(xiàn)最好，本人 4 4 號(hào)劃線(xiàn)不好，還是沒(méi)有劃好。2 2 號(hào)同學(xué)效 果不好，可能取菌過(guò)少。 4:濃汁標(biāo)本中白色菌落3:濃汁標(biāo)本中

17、金黃色菌落 2:糞便標(biāo)本中粉色菌落1:糞便標(biāo)本中紫黑色菌落 藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析 青霉素 頭抱曲松 慶大毒素 金黃色 + + + 白色 + + 紫黑 - + + 粉紅 - + + -:耐藥 士：中度敏感 十:敏感 白色細(xì)菌對(duì)對(duì)青霉素敏感，對(duì)頭抱曲松中度敏感，對(duì)慶大毒素敏感 金黃細(xì)菌對(duì)青霉素敏感，對(duì)頭抱曲松敏感，對(duì)慶大毒素敏感紫黑細(xì)菌對(duì)青霉素耐藥，對(duì)頭抱曲松敏感，對(duì)慶大毒素敏感粉紅細(xì)菌對(duì)青霉素耐藥，對(duì)頭抱曲松敏感，對(duì)慶大毒素敏感（4 4）血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 金黃色（左）與白色（右）菌苔 1 1、白色菌苔不發(fā)生凝塊，容易涂抹。呈均勻乳白狀態(tài)。 2 2、黃色菌苔能產(chǎn)生血漿凝固酶，可使血漿中的纖維蛋白原

18、轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白，附著于菌體表面，形成凝塊，涂抹不開(kāi)。說(shuō)明黃色細(xì)菌為致病菌。 7 7.玻片凝集試驗(yàn): 由實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖可看到，生理鹽水一端（左）不出現(xiàn)凝集，福氏志賀菌診斷血清一端（右）菌液雖然不是很不明顯，但是可以看到任有少量絮狀沉淀，表明為陽(yáng)性。說(shuō)明粉紅菌為福氏志賀菌。 8.8.結(jié)論： 對(duì)照對(duì)照常見(jiàn)腸道感染細(xì)菌主要生化反應(yīng)特征，血清學(xué)分析，說(shuō)明黃色菌落是金黃色葡萄球菌；白色菌落是白色葡萄球菌；紫黑色菌落是大腸埃希菌；粉紅色菌落是福氏志賀菌。 （二）實(shí)驗(yàn)討論 1 1 . .分析： 制備好培養(yǎng)基后，首先采用平板劃線(xiàn)分離法，從膿汁標(biāo)本中分離出金黃色和白色兩種菌落。顯微鏡下，這兩株細(xì)菌均為 G+G+求菌，排列不規(guī)則，呈葡萄用狀，是典型的葡萄球菌；結(jié)合菌落或菌苔顏色，這兩株葡萄球菌分別是金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌。通過(guò)血漿凝固酶試驗(yàn)鑒別，金黃色葡萄球菌是致病菌。最后通過(guò)藥敏試驗(yàn)，可見(jiàn)不同的抗生素所形成的抑菌圈不同，其中金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素最敏感，而紫黑和粉紅細(xì)菌對(duì)青霉素