仙人掌黃酮對活化巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮及一氧化氮合酶的抑制作用

1、仙人掌黃酮對活化巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮及一氧化氮合酶的抑制作用 趙 烽1*，邱鷹昆1，竇德強(qiáng)2，姜永濤1，劉 珂1 （1. 煙臺大學(xué)藥學(xué)院，煙臺 264005；2. 沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，沈陽 110016）摘要：目的 研究從仙人掌中分離的12種黃酮化合物對活化巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮及一氧化氮合酶的抑制作用，探討構(gòu)效關(guān)系。方法 采用LPS/IFN-誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7釋放一氧化氮，通過Griess法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中一氧化氮的濃度，計(jì)算仙人掌黃酮對小鼠巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮的抑制率，以MTT法評價(jià)細(xì)胞毒性。通過SDS/PAGE、Western Blot的方法檢測仙人掌黃酮對一氧化氮合

2、酶的影響。結(jié)果 仙人掌黃酮2-7在12.5100 mol · L-1的劑量范圍內(nèi)可明顯抑制活化巨噬細(xì)胞釋放NO，并呈現(xiàn)良好的劑量依賴關(guān)系。黃酮類化合物C環(huán)2，3位雙鍵對一氧化氮抑制活性具有關(guān)鍵性作用，環(huán)上羥基的位置、數(shù)目對活性無顯著影響。結(jié)論 仙人掌黃酮對活化巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮及一氧化氮合酶的抑制作用將為應(yīng)用仙人掌治療炎癥疾病提供理論解釋和科學(xué)依據(jù)。關(guān)鍵詞：仙人掌；黃酮；一氧化氮（NO）；一氧化氮合酶；構(gòu)效關(guān)系*通訊作者：趙烽，女，副教授，研究領(lǐng)域?yàn)橹兴幱行С煞值纳锘钚约敖Y(jié)構(gòu)優(yōu)化。Tel：(0535)6706921，F(xiàn)ax：(0535)6706066，E-mail：zhaofen

3、gEffect of Flavonoids from Opuntia dillenii on NO Release and iNOS Expression in Activated Mouse MacrophageZHAO Feng1*, QIU Ying-kun1, DOU De-qiang2, JIANG Yong-tao1, LIU Ke1(1. School of Pharmacy, Yantai University, Yantai 264005, China; 2. School of Traditional Chinese Materia Medica, Shenyang Pha

4、rmaceutical University, Shenyang 110016，China)ABSTRACT: OBJECTIVE To evaluate the inhibitory activity of flavonoids from Opuntia dillenii on LPS/IFN- induced NO release in mouse macrophage, and study the Structure-Activity Relationship (SAR). METHODS NO release was induced by a combination of lipopo

5、lysaccharide (LPS) and interferon- (IFN-), and determined by Griess assay. Cytotoxicity was evaluated by MTT method. Expression of iNOS was detected by using SDS/PAGE and Western blot. RESULTS Flavonoids 2-7 isolated from Opuntia dillenii strongly inhibited LPS/IFN- induced NO release and iNOS expre

6、ssion, and showed good dose-dependency. The double bond between the second and third positions is very important for the NO inhibitory activity. Position or amount of hydroxyl groups may be not necessary for inhibiting NO production. CONCLUSION The inhibitory effect of flavonoids isolated from Opunt

7、ia dillenii on NO release and iNOS expression may provide appropriate explanation for the anti-inflammatory treatment using this plant. KEY WORDS: Opuntia dillenii; flavonoid; NO; iNOS; SAR仙人掌Opuntia dillenii (Ker-Gaw.) Haw.為仙人掌科Cactaceae仙人掌屬植物,主要分布于我國南部沿海沙灘上1。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為，仙人掌性寒味苦，具有解毒鎮(zhèn)痛、消腫排膿、行氣活血之功效，均與

8、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的抗炎有關(guān)。臨床上，常用于治療流行性腮腺炎2，乳癰，靜脈炎，心動過速，胃、十二指腸潰瘍，熱嗽，手癬，足跟痛，小兒驚風(fēng)，支氣管哮喘，蛇傷以及由于注射引起的硬結(jié)，腫塊，感染等病癥；在國外，仙人掌植物主要用于治療糖尿病、潰瘍等，墨西哥目前已開發(fā)生產(chǎn)了治療糖尿病的片劑和膠丸。作者曾對該植物的化學(xué)成分進(jìn)行了較為深入的研究，先后從該植物中分離得到黃酮、有機(jī)酸、吡喃酮等多種成分3-6，本文研究了從仙人掌中分離得到的12種黃酮成分對脂多糖（LPS）聯(lián)合干擾素（IFN-）誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)一氧化氮（NO）及一氧化氮合酶（iNOS）的影響。1 材料與方法1.1 材料1.1.1藥物 仙人掌黃酮單

9、體1-12由煙臺大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室分離純化，具體分離流程及結(jié)構(gòu)鑒定詳見以前報(bào)道5。實(shí)驗(yàn)前以DMSO配制成所需濃度，-20保存?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式及英文名稱如表1所示。表1 從仙人掌中分離的黃酮單體1-12化學(xué)結(jié)構(gòu)式Table 1 Chemical structures of flavonoids 1-12 isolated from O. dillenii.ComdNameStructure1aromadendrin2-12R1R2R3R4R52kaempferolOHHOHOHOH3querceitnOHOHOHOHOH4kaempferideOHHOCH3OHOH53-O-methyl

10、querceitnOCH3OHOHOHOH63-O-methyl isorhamnetinOCH3OCH3OHOHOH7kaempferol 7-O-b-D-glucopyranosideOHHOHGlcOH8kaempferol 7-O-b-D- glucopyranosyl (1®4)-b-D- glucopyranosideOHHOHGlc(4®1)GlcOH93-O-methyl quercetin 7-O-b-D- glucopyranosideOCH3OHOHGlcOH10rutinGlc(6®1)RhaOHOHOHOH11isorhamnetin-3

11、-O-b-D-rutinosideGlc(6®1)RhaOCH3OHOHOH12manghaslinGlc(6®1)Rha (2®1)RhaOCH3OHOHOH1.1.2 藥品及試劑 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、MTT購自Sigma公司；重組人干擾素（IFN-）購自和光純藥株式會社（日本大阪）； RPMI 1640培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、胎牛血清購自Gibco公司；抗iNOS多克隆抗體（美國，Biomol）；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二次抗體（Amersham）；其他常用生化試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2 方法1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠單核巨

12、噬細(xì)胞RAW 264.7購自中科院上海細(xì)胞庫（ATCC TIB-71），培養(yǎng)于含10%熱滅活（56，30 min）胎牛血清（FBS）、100 U · mL-1青霉素鈉、100 mg · mL-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育生長，隔天傳代。1.2.2 NO釋放量的測定7-8 由于NO極不穩(wěn)定，在細(xì)胞培養(yǎng)上清液內(nèi)很快代謝成亞硝酸基（NO2-），故采用Griess法測定樣品中NO2-的濃度作為衡量NO水平的指標(biāo)。Griess試劑A：0.1 % N-萘乙二胺鹽酸鹽；Griess試劑B：5% H3PO4含1%對氨基苯磺酰胺，使用前等體積混合試

13、劑A和B。用RPMI 1640培養(yǎng)基將RAW 264.7細(xì)胞稀釋至5×105 cells · mL-1，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200 L細(xì)胞懸浮液。CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，每孔加入LPS (100 ng · mL-1)、IFN-g (100 units · mL-1)和不同濃度的測試樣品0.4 L，以0.4 L的DMSO作為空白對照組，同時(shí)設(shè)LPS/IFN-組（不加入被測試仙人掌黃酮），每個(gè)樣品4個(gè)重復(fù)。在37、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后吸取培養(yǎng)液上清100 L至酶標(biāo)板中，加入等體積的Griess試劑，室溫反應(yīng)10 min后測定54

14、0 nm處的吸光值。用濃度分別為1、5、10、50 µmol · L-1的NaNO2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO2-的濃度以及對NO釋放的抑制率，抑制率計(jì)算公式為： NO2- LPS/IFN - NO2- LPS/IFN+樣品NO釋放抑制率（%）= 100 × NO2- LPS/IFN - NO2- 空白1.2.3 細(xì)胞毒性評價(jià)（MTT） 加入藥物處理24 h后，吸取100 L上清液測定NO釋放量，另外向每孔中加入MTT溶液（5 mg · mL-1）4 L，置于5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清，吸干殘留液體，

15、加入DMSO 150 L，在搖床上振搖10 min使生成的甲瓚結(jié)晶充分溶解后，設(shè)定630 nm為參比波長，在570 nm下測定吸光值。A570nm LPS/IFN+樣品細(xì)胞存活率 （%）= 100 ×A570nm 空白1.2.4 SDS/PAGE-Western Blot檢測iNOS 收集細(xì)胞，經(jīng)PBS溶液清洗2次后，超聲破碎制備蛋白質(zhì)樣品，并以Bradford法測定樣品中總蛋白含量。將含有等量總蛋白（10 g）的樣品與5×樣品緩沖液混合，置沸水浴中加熱使蛋白變性后行7.5% SDS/PAGE電泳。電泳完畢后將分離膠部分進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。用T-TBS溶液清洗硝酸纖維素膜后置于含50

16、 g/L脫脂奶粉的T-TBS溶液中封閉1 h。然后用T-TBS溶液清洗膜，置于抗iNOS一抗溶液中溫育1 h后，用T-TBS溶液清洗膜。然后將膜置于HRP標(biāo)記的抗兔IgG二抗溶液中溫育1 h后，用T-TBS溶液清洗膜。將清洗后的硝酸纖維素膜按照ECL試劑盒說明書將結(jié)果顯影于膠片上。2 結(jié)果2.1 仙人掌黃酮對LPS/IFN-誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞釋放NO的抑制作用仙人掌黃酮1-12在10012.5 mol · L-1的濃度范圍內(nèi)對活化小鼠巨噬細(xì)胞釋放NO表現(xiàn)出不同程度的抑制活性。表2數(shù)據(jù)為1-12對活化巨噬細(xì)胞釋放NO的抑制率。其中27表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，1、812的活性較弱，在100

17、 mol · L-1的濃度下未能明顯抑制活化巨噬細(xì)胞釋放NO。表2 黃酮單體1-12對巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of flavonoids 1-12 on the NO productionµmol· L-1NO抑制率（%）µmol · L-1NO抑制率（%）110027.25 ± 2.86 710060.59 ± 4.295011.09 ± 2.865050.48 ± 1.43253.52 ± 2.142540.89 ± 7.

18、2412.50.49 ± 6.4312.534.83 ± 2.14210093.81 ± 5.46*810024.73 ± 5.755077.18 ± 5.925013.62 ± 3.572532.23 ± 4.002513.11 ± 2.8612.521.16 ± 6.4512.59.07 ± 4.29310093.80 ± 7.83910047.96 ± 0.715083.05 ± 3.925033.82 ± 3.572548.52 ± 5.

19、532524.73 ± 3.2812.538.75 ± 0.8712.520.69 ± 6.43410093.92 ± 4.29*1010028.77 ± 4.285067.66 ± 8.575015.64 ± 0.712533.82 ± 0.71253.52 ± 5.7112.535.33 ± 2.8612.5-1.58 ± 2.14510081.09 ± 2.761110024.75 ± 0.765054.38 ± 7.375016.65 ±

20、 0.712522.46 ± 0.9625-1.53 ± 3.5712.515.95 ± 1.8412.5-0.02 ± 7.866100 97.96 ± 5.32*1210033.31 ± 7.145080.28 ± 3.57*5020.18 ± 5.712537.86 ± 5.822513.62 ± 2.1412.529.78 ± 6.4312.510.59 ± 5.16*：細(xì)胞存活率<50%，強(qiáng)細(xì)胞毒性；*：50%<細(xì)胞存活率<70%，中等細(xì)胞毒性；*

21、：70%<細(xì)胞存活率<90%，弱細(xì)胞毒性；細(xì)胞存活率>90%，無細(xì)胞毒性。MTT測定結(jié)果表明，除2、4、6在高濃度劑量時(shí)表現(xiàn)出細(xì)胞毒性外，其余黃酮單體在抑制NO釋放的活性濃度范圍內(nèi)對細(xì)胞增殖均無明顯影響（詳見表2）。相比之下，3和5表現(xiàn)出更強(qiáng)的生物活性，而對細(xì)胞的正常增殖無影響。2.2 構(gòu)效關(guān)系探討通過比較化學(xué)結(jié)構(gòu)和活性測試結(jié)果，作者對仙人掌黃酮抑制NO釋放活性的構(gòu)效關(guān)系規(guī)律做了初步的總結(jié)。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，1為二氫黃酮醇，2-12結(jié)構(gòu)母核均為黃酮醇，只是側(cè)鏈的取代基團(tuán)種類和數(shù)目有所不同。1和2側(cè)鏈上取代基團(tuán)完全相同，不同之處僅在于1的母核為二氫黃酮醇，2的母核為黃酮醇；同樣在

22、100 mol · L-1的濃度下，2對RAW 264.7細(xì)胞釋放NO的抑制率為93.81%，1的抑制率僅為27.25%。提示黃酮類化合物C環(huán)2，3位雙鍵對NO釋放抑制活性的關(guān)鍵性作用（圖1A）。如圖1B所示，化合物3比2在B環(huán)3位置多了一個(gè)羥基，但是二者的活性結(jié)果無明顯差異；與化合物2相比，4-6不同環(huán)上不同位置的羥基被甲氧基取代，但是其活性均與化合物2無明顯差異，提示環(huán)上羥基的位置、數(shù)目對活性無顯著影響。如圖1C所示，化合物7為2的葡萄糖苷（A環(huán)7位），8為相同位置上的雙糖苷，活性強(qiáng)弱順序依次為：2>7>8，表明苷元糖苷化后活性降低，且連糖的數(shù)目越多活性越弱。另外，化

23、合物9為化合物5的葡萄糖苷，活性也相應(yīng)減弱（圖1D）；化合物10為化合物3的二糖苷，活性相對減弱（圖1E）；化合物11和12分別為化合物6的二糖苷和三糖苷，活性以6最強(qiáng)，11和12的活性明顯降低（圖1F），均表現(xiàn)出完全類似的構(gòu)效關(guān)系規(guī)律。圖1 構(gòu)效關(guān)系Fig 1 Structure-activity relationship2.3 仙人掌黃酮對一氧化氮合酶的影響利用SDS/PAGE-Western法考察了仙人掌黃酮對小鼠巨噬細(xì)胞一氧化氮合酶蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，結(jié)果表明，化合物2、3、6在100 mol · L-1的濃度下能夠明顯抑制LPS/IFN-誘導(dǎo)的一氧化氮合酶蛋白質(zhì)表達(dá)，其余黃酮

24、單體在相同濃度下對一氧化氮合酶的蛋白質(zhì)表達(dá)無顯著影響（見圖2）。這種抑制作用與它們對小鼠巨噬細(xì)胞釋放NO的抑制結(jié)果表現(xiàn)出一致性，提示仙人掌黃酮可以通過影響iNOS實(shí)現(xiàn)對小鼠巨噬細(xì)胞釋放NO的抑制作用。LPS/IFN-g-+compd (100 mmol · L-1)-123456iNOS ®LPS/IFN-g-+compd (100 mmol · L-1)-789101112iNOS ®圖2 黃酮單體1-12對iNOS蛋白表達(dá)的影響Fig 2 Effect of flavonoids 1-12 on the iNOS expression3 討 論巨噬細(xì)

25、胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要遞呈細(xì)胞，在特異性和非特異性免疫過程中發(fā)揮著重要的作用。巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答是機(jī)體發(fā)揮防御機(jī)制的基礎(chǔ)，當(dāng)細(xì)菌繁殖和被殺死時(shí)，有大量的內(nèi)毒素釋放到體液中，刺激巨噬細(xì)胞的活化并釋放過量炎癥遞質(zhì)從而造成瀑布式的炎癥失控性反應(yīng)，使組織損傷并成為炎癥的重要病理過程。通過對活化巨噬細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，從而調(diào)控免疫功能很可能是一條有效的抗炎藥物發(fā)現(xiàn)的新途徑。作為巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)過程中產(chǎn)生的一類重要的自由基，NO的合成和釋放發(fā)揮宿主防御反應(yīng)和信號傳遞功能。通過測定對誘導(dǎo)型NO的抑制作用，很可能是從中草藥中篩選抗炎藥物的有效途徑。作者發(fā)現(xiàn)從仙人掌中分離的黃酮化合物可抑制由LPS/IFN-引起的巨噬

26、細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)NO，提示該中藥在炎癥及免疫疾病中的應(yīng)用價(jià)值，為臨床應(yīng)用仙人掌治療炎癥疾病和仙人掌植物的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了科學(xué)的理論依據(jù)。REFERENCES1 Jiangsu New Medical College. Dictionary of Chinese Materia Medica(中藥大辭典)M. Shanghai, Shanghai Peoples Publishing House, 1977.2 Lu X X, Tian W Z. Clinical Observation on Opuntia dillenii (Ker-Gaw.) Haw. in the Treatment of 128 Cases of Epidemic ParotitisJ. Zhejiang Journal of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine(浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志), 2001, 11(8): 511-512.3 Qiu Y K, Chen Y J. Studies on the herbs