淺議枳實對糖尿病小鼠腎臟抗氧化能力及胰島影響

1、淺議枳實對糖尿病小鼠腎臟抗氧化能力及胰島影響    【摘要】  目的 研究枳實提取物對實驗性糖尿病小鼠腎臟抗氧化能力及胰島形態(tài)的影響。方法 將枳實提取物分成高、中、低劑量5.1，3.4，1.7 g / (kg·bw)治療糖尿病小鼠4周后，觀察其一般狀況、腎臟的抗氧化能力及胰島形態(tài)變化。結(jié)果 枳實高劑量組小鼠末期血糖為(20.37±5.25)mmol/L，明顯低于糖尿病組的(25.74±2.99) mmol/L(P<0.05);枳實

2、高劑量組谷胱甘肽(GSH)含量為(34.40±8.54) mg/(g·prot)，明顯高于糖尿病組的(21.38±3.91)mg/(g·prot)(P<0.01);枳實高劑量組丙二醛(MDA)和NO含量分別為(0.89±0.37)nmol/(mg·prot)，(1.27±0.56)mol/(g·prot)，明顯低于糖尿病組的(1.46±0.39) nmol/(mg·prot)，(2.15±0.85)mol/(g·prot)(P<0.01或P&l

3、t;0.05)，光鏡下枳實提取物治療組胰島細胞損傷程度較糖尿病組輕。結(jié)論 枳實提取物能增強腎臟的抗氧化能力;保護胰島組織細胞并降低胰島細胞損傷。 【關(guān)鍵詞】  枳實;糖尿病小鼠;腎臟;胰島;抗氧化功能Effects of Citrus aurantium on kidney antioxidant function and islet in experimental diabetic mice JIAO S

4、hirong，HUANG Chengyu，WANG Bo，et al.School of Bioengineering of Xihua University(Chengdu 610039,China)Abstract： Objective To study the effect of Citrus aurantium(C.aurantium) extract on kidney ant

5、ioxidant ability and islet in experimental diabetic mice.Methods Experimental diabetic mice were treat with C.aurantium extract (1.7,3.4,5.1g C.aurantium extract / kg).After 4 weeks,the 

6、;general status,kidney antioxidant ability and morphological change of islet were observed.Results The blood glucose of diabetic mice treated with high dose of C.aurantium extract 

7、was significantly lower that of untreated mice(20.37±5.25 vs 25.74±2.99 mmol/L,P<0.05).The content of glutathione of high dose C.auratiocm treated mice was significantly higher 

8、that of untreated diebetic mice(34.40±8.54 vs 21.38±3.91 mg/g·prot,P<0.05).The mice treated with high dose C. auranticm had a lower maleic dialdehyde(0.89±0.37 vs 1.46±

9、;0.39 nmol/mg·prot,P<0.01) and nitric oxde(1.27±5.6 vs 2.15±0.85 umol/g·prot,P<0.05) compared with untreated diabic mice.Minor morphological damage of islets in C.aurantium treate

10、d mice were observed compared with untreated diabetic mice.Conclusion The extract of C.aurantium can effectively enhance the kidney antioxidant function and decrease islets cell da

11、mages.Key words：Citrus aurantium;diabetic mouse;kidney;islet;antioxidant defense function枳實(Citrus aurantium，ZhiShi)為蕓香科植物酸橙(Citrus aurantium L)及其栽培變種或甜橙的干燥幼果，是臨床常用中藥1 ，也可用于保健食品。經(jīng)高效液相色譜(HPLC)測定，枳實中含柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等類黃酮，且含量較高。研究表明，枳實提取物具有較強的體外抗氧化作用2。近年來，抗氧化能力降

12、低在誘發(fā)糖尿病并發(fā)癥方面日益受到重視，氧化應激帶來的臟器損傷可能是糖尿病多種并發(fā)癥發(fā)病機制的共同通道3，4。國內(nèi)外對蕓香科植物中黃酮類物質(zhì)的抗氧化作用進行了較多研究5，而有關(guān)枳實的體內(nèi)抗氧化作用研究報道較少。 本研究旨在探討枳實提取物對糖尿病小鼠腎臟抗氧化能力的影響及胰島細胞保護作用，為減輕糖尿病并發(fā)癥和開發(fā)枳實資源提供科學依據(jù)。1 材料與方法  法學論文網(wǎng)1.1 材料1.1.1 枳實 購買自成都荷花池中藥材市場，經(jīng)鑒定為酸橙幼果。1.1.2 實驗動物 80只屏障級雄性昆明種小鼠(四川省醫(yī)科院動物所，合格

13、證號：醫(yī)動字第24101106號)，體重為1720 g。其中10只用于正常對照組，70只用于糖尿病小鼠模型的建立，得到40只糖尿病模型小鼠。1.1.3 主要儀器與試劑 GT-1640型血糖儀(日本ARKRAY公司);722紫外可見光分光光度計(江蘇揚中綠揚分析儀器廠);恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠);5810R冷凍型高速離心機(德國EPPENDORF公司);Olympus BX60 熒光正置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。GLUCOCARDTM Test Strip血糖試紙(批號：77502，美國LIFESCAN公司

14、);鏈脲佐菌素(德國MERK公司);丙二醛(MDA)、NO、谷胱甘肽(GSH)含量，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、過氧化氫酶(CAT)、一氧化氮合酶(NOS)活性以及組織蛋白含量的測定試劑盒(南京建成生物研究所)。1.2 方法1.2.1 枳實提取物的制備 參照文獻2。1.2.2 糖尿病模型小鼠的建立 雄性昆明種小鼠，常規(guī)飼料適應性飼養(yǎng)1周后，腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，72 h后再加強注射1次，每次80 mg/(kg·bw) ，正常組注射等量的檸檬酸緩沖液。加強注射后的第4&#

15、160;d，測空腹血糖，禁食35 h、尾靜脈全血血糖11.1 mmol/L6的小鼠判定為糖尿病成功動物模型。1.2.3 動物分組及處理 40只成模糖尿病小鼠按血糖隨機分為：糖尿病模型組(DM)組、枳實低(ZL)、中(ZM)、高劑量(ZH)組，同時設(shè)正常對照(NC)組，每組10只。低、中、高劑量組動物分別按每千克體重1.69，3.37，5.07 g枳實提取物灌胃。對照組和糖尿病組以0.4 ml蒸餾水灌胃，各組均每日灌胃1次，共4周。整個實驗過程中均在獨立通風籠系統(tǒng)動物房喂養(yǎng)，糖尿病組小鼠自由進食高脂飼料(常規(guī)飼料加10%豬油)和飲水，正

16、常組自由進食常規(guī)飼料和飲水，室溫2024 ，濕度60%70%，12 h/12 h明暗周期。1.2.4 觀察指標及測定方法 試驗過程中每周稱體重，血糖水平用葡萄糖試紙檢測。在第4周末，稱重，斷頸處死動物，取腎臟稱重,測定腎臟指數(shù)(腎臟重量/小鼠體重)。稱取適量腎組織，加冷生理鹽水，在冰浴條件下，制成10%的組織勻漿，低溫低速離心，取上清液。SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定，CAT活性采用紫外分光光度法測定，GPx活性和GSH含量采用二硫代二硝基苯甲酸比色法測定。NO含量和NOS活性采用硝酸還原酶比色法測定，MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)縮合

17、法測定，組織蛋白含量采用考馬斯亮蘭法測定。具體測定方法參照試劑盒說明書。1.2.5 組織學檢查 留取胰腺標本，甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡觀察。1.3 統(tǒng)計分析 應用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行獨立樣本t檢驗。2 結(jié) 果2.1 枳實提取物成分 總黃酮含量為(0.699±0.008)g/g。經(jīng)HPLC測定，枳實提取物中柚皮苷為21.15%、橙皮苷為1.09%、新橙皮苷為19.10%、蘆丁為0.02%、槲皮素為0.04%。2.2 血糖、體重及腎臟系數(shù)比較

18、(表1) 喂養(yǎng)初期各組小鼠體重差異無統(tǒng)計學意義，末期DM組小鼠體重低于NC組(P<0.01)，提示糖尿病對小鼠生長可能有抑制作用。試驗末期，DM組小鼠血糖高于NC組(P<0.01)，ZH組血糖低于DM組(P<0.05)，提示高劑量枳實具有降低血糖的作用。DM組末期腎臟指數(shù)高于NC組(P<0.01)，枳實各劑量組與DM組之間差異無統(tǒng)計學意義。表1 各組小鼠一般情況比較注：與DM組比較，a P<0.01，b P<0.05。2.3 各組小鼠腎臟氧化應激情況(表2) 試驗末期，DM組小鼠腎臟組織中GPx、S

19、OD活性、MDA和NO含量均明顯高于NC組，CAT、NOS活性和GSH含量均明顯低于NC組(P<0.01)。與DM組比較，ZL、ZM、ZH組小鼠腎臟MDA和NO含量均明顯下降，GSH含量均明顯升高(P<0.01或P<0.05);ZH組GPx、CAT活性均明顯升高(P<0.01);ZM組GPx、CAT、SOD活性均明顯降低(P<0.01);NOS活性差異無統(tǒng)計學意義。2.4 胰島形態(tài)學檢查 光鏡下正常小鼠(NC組)胰島形態(tài)無異常，呈橢圓形，大小不一，散在分布于外分泌組織之間，胰島內(nèi)分泌細胞均勻分布，細胞呈圓形，大小較均勻，核居細胞中央，見圖1。糖

20、尿病小鼠(DM組)胰島體積明顯縮小、數(shù)量明顯減少，形態(tài)不規(guī)則    ，內(nèi)分泌細胞空泡化明顯，部分細胞核固縮、核消失明顯，細胞間隙增大，見圖2。與DM組相比，ZL組胰島體積變小，數(shù)量減少，胰島細胞空泡化及核固縮等變化程度與DM組相似;ZM組胰島體積變小、數(shù)量減少，胰島細胞空泡化等較DM組減輕;ZH組半數(shù)(5/10)動物胰島內(nèi)分泌細胞損傷較DM組明顯減輕，見圖3。表2 各組小鼠腎臟氧化應激情況注：與DM組比較，a P<0.01，b P<0.05。圖1 正常小鼠胰島組織形態(tài) (×400)3

21、 討 論研究表明，氧化應激存在于糖尿病發(fā)病過程中7，8,隨著高血糖的持續(xù)，組織中自由基增加9，產(chǎn)生活性氧自由基(ROS)引起組織損傷。這種損傷作用主要是通過自由基對體內(nèi)的脫氧核糖核酸、蛋白質(zhì)和脂肪的氧化修飾實現(xiàn)，并因此導致后期的糖尿病并發(fā)癥10。本試驗測定腎臟指數(shù)，DM組明顯高于NC組，可能是由于糖尿病小鼠高血糖導致產(chǎn)生應激，腎臟代償性增大7。研究還發(fā)現(xiàn)，DM組小鼠腎組織與NC組比較，CAT、NOS活性和GSH含量明顯降低， GPx、SOD活性、MDA和NO含量明顯升高，表明糖尿病小鼠處于抗氧化防御機能低下狀態(tài)。給予枳實提取物治療后，與DM組比較，小鼠MDA、NO

22、含量明顯降低，GSH含量明顯升高，CAT活性明顯升高，表明枳實提取物能提高糖尿病小鼠腎臟抗氧化酶活性，抑制脂質(zhì)過氧化反應，對糖尿病小鼠抗氧化防御功能具有一定的恢復作用，胰腺組織切片光鏡觀察可見，糖尿病小鼠胰島細胞受到損傷。高劑量枳實能保護胰島細胞免受損傷，同時還具有降低血糖的作用。關(guān)于其降糖機制有待于進一步研究。【參考文獻】  1 田代華.實用中藥詞典M.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002:1341.2 焦士蓉，馬力，黃承鈺，等.枳實提取物的體外抗氧化作用研究J.中藥材，2008，31(1)：113-116.3 牟忠卿,陳麗,傅藝凌，等.糖尿病大鼠

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24、;MK,et al.Antioxidative activity of naringin and lovastatin in high cholesterolfed rabbitsJ.Life Sciences,2001,69:2855-2866.6 楊潤軍,李青旺,趙蕊.四氧嘧啶與鏈脲佐菌素誘導小鼠糖尿病模型的效果比較J.西北農(nóng)林科技大學學報，2006，32(2):17-19.7 Lapshina EA,Sudnikovich EJ,Maksimchik JZ,et al.Antioxidative enzyme and glutathione Stransferase activities