WESTERNBLOT操作步驟圖

1、WESTERN BLOTTING過程圖解過程圖解 圖中綠色的是夾玻璃片的架子玻璃板對齊后放入架中，把兩側的夾子卡緊。要使短玻璃靠外，長玻璃靠內。然后垂直卡在架子上準備灌膠。操作時要使兩玻璃對齊，以免漏膠。 圖示兩塊玻璃板放在一個架子上。配10分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時，可用10ml槍吸取5ml膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢，否則膠會被沖變型。） 當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等3min使膠

2、充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。按前面方法配4的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。如果有氣泡，可以用濾紙條將其吸出來 均勻插入梳子 梳子已經(jīng)插好。插梳子時要使梳子保持水平。由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補膠。 濃縮膠干后，用手拿住梳子的兩邊均勻用力，拔起梳子 將玻璃板從夾子上取下，用水沖一下將玻璃板放入電泳槽中。小玻璃板面向內，大玻璃板面向外 插入另一塊玻璃板，也是小玻璃板面向內，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊

3、一塊塑料板且有字的一面面向外 兩塊玻璃板都放好后夾緊（拇指按下夾子） 放入電泳槽中向內槽中加電泳緩沖液，如果不漏，在向外槽中加，如果漏，就要重新把玻板查好，使內外不交通。 電泳液至少要漫過內側的小玻璃板。 測完蛋白含量后，所有蛋白樣品調至等濃度后上樣。取出上樣樣品至0.5ml離心管中，加入5SDS 上樣緩沖液至終濃度為1。（上樣總體積一般不超過15l，加樣孔的最大限度可加20l樣品。）上樣前要將樣品于沸水中煮5min使蛋白變性。加足夠的電泳液后開始準備上樣。用微量進樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品

4、溢出。加入下一個樣品時，進樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染電泳時間一般1-2 h，電壓為100V較好，也可用60V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳。 取出轉移槽 取下玻璃板 兩塊玻璃板都已經(jīng)取下要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復撬。撬一會兒玻璃板便開始松動，直到撬去玻板。（撬時一定要小心，玻板很易裂。） 將濃縮膠（濃縮膠影響操作）和分離膠上不用的部分切去在加有轉移液的搪瓷盤里放入轉膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜，將夾子打開使白的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回搟幾遍以搟走里面的氣泡 。 在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊

5、在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。依次加膜、加膠，再在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個操作在轉移液中進行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路。轉移液含甲醇，操作時要戴手套，實驗室要開門以使空氣流通。 合起夾子將夾子放入轉移槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。 電轉移時會產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。 加上轉移緩沖液 蓋上蓋子,放入乘有水的水槽中,水槽中加冰袋 電轉移200mA 2-3h后，打開蓋子，取出夾子打開夾子，取出膜，如果所用marker是預染marker,可見marker已經(jīng)轉移到膜上,如果不是預染marker，可以把膜轉完后將膜用1麗春紅染液染5min，于脫色搖床上搖，然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。 將膜晾干備用。 將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中 室溫下脫色搖床上搖動封閉1h。 按所需稀釋濃度滴加一抗（直接加在封閉液里）4 過夜或37 3h