果蠅唾腺染色體的標(biāo)本制備和觀察

1、果蠅唾腺染色體的標(biāo)本制備和觀察摘要多線染色體存在于某些生物特定生命周期的某些細(xì)胞中。本實驗觀察的多線染色體是果蠅唾腺染色體，在其染色體標(biāo)本中可以觀察到果蠅唾腺染色體形態(tài)巨大，由5條長染色體和1條短小的染色體組成，他們聚集在染色中心，橫紋條帶深淺不一，疏密各異，遍布每條多線染色體臂，有些地方有還脹泡出現(xiàn)。由于多線染色體因其形態(tài)巨大，橫紋明顯，它常被作為基因定位的良好材料，并且廣泛應(yīng)用于細(xì)胞遺傳學(xué)、發(fā)生遺傳學(xué)、進(jìn)化遺傳學(xué)及分子遺傳學(xué)的研究中。關(guān)鍵詞 多線染色體 果蠅唾腺染色體橫紋 脹泡1.引言染色體由DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，作為DNA的載體，有著不可或缺的的作用，因此是科學(xué)家廣泛研究的材料。然而染色體

2、的研究通常面臨兩個困難：一是染色體很??；二是除極少數(shù)動植物，如玉米粗線期的染色體上具有染色粒這樣的結(jié)構(gòu)可以作為識別或定位的標(biāo)志外，大多數(shù)生物的染色體都沒有標(biāo)志。而多線染色體的染色體足夠大，染色體上的識別標(biāo)記足夠多，這將對遺傳學(xué)研究將提供不少的便利。本次實驗觀察的多線染色體有如下特征： 果蠅唾腺染色體是一種纜狀的巨大染色體。由于果蠅幼蟲的唾腺細(xì)胞發(fā)育至一定階段就停止有絲分裂，終止在間期，但唾液腺細(xì)胞核的染色體仍不斷地進(jìn)行自我復(fù)制，但并未發(fā)生細(xì)胞核分裂，復(fù)制后的子染色體彼此不分開，形成了多線染色體，對于黑腹果蠅唾腺染色質(zhì)的復(fù)制可達(dá)9次之多，單條染色體臂可達(dá)275m，約為普通中期染色體的150倍。果

3、蠅唾腺染色體由5條長染色體和1條短小的染色體組成，他們聚集在染色中心。唾腺染色體由于體聯(lián)會的原因只有二倍體的單元數(shù)，第染色體（X染色體）為端著絲粒，所以染色體的一端在染色中心上，另一端游離，第、染色體均為中著絲粒，它們從染色體中心呈V字形向外伸展，所以分別能看到2L(left arm)、2R( right arm) 、3L和3R4條長臂；點狀的第染色體很短小，為端著絲粒。因此，可以見到5條很長的和一條緊靠染色體中心的短小的染色體。在雄性幼蟲中，唾腺染色體上不見Y染色體，它不與X染色體聯(lián)會，而且其著絲粒及其附近的異染色質(zhì)參與染色中心的形成。這可能是雄性幼蟲唾腺染色體中的X染色體比其他幾對常染色體

4、相對狹窄一些的緣故。染色中心是唾腺染色體形成時，各條染色體的著絲粒和近著絲粒的異染色質(zhì)區(qū)聚積在一起形成一種結(jié)構(gòu)，此處的染色質(zhì)連接不緊密，橫紋結(jié)構(gòu)也不明顯。果蠅唾腺染色體橫紋條帶深淺不一，疏密各異，遍布每條多線染色體臂。染色質(zhì)絲的不同部位螺旋化程度不同。其中螺旋化程度較高的形成染色較深的暗紋，螺旋化程度較低的部位形成了染色較淺的明紋。橫紋數(shù)量巨大，在黑腹果蠅中可達(dá)5000多條。果蠅唾腺染色體每一臂上所有的橫紋的數(shù)目、大小和位置是恒定的，即具有種的特征，橫紋又與某些特定的基因相聯(lián)系，因此其可以作為基因定位的依據(jù)，橫紋數(shù)目和排列的變化可以作為染色體結(jié)構(gòu)改變（缺失、倒位、易位等）的依據(jù)。果蠅唾腺染色體

5、臂上可觀察到脹泡。當(dāng)基因活躍轉(zhuǎn)錄的時候，多線染色體上的DNA會解開螺旋，染色體某些帶紋變得疏松膨大而形成脹泡。不論是在經(jīng)典的細(xì)胞遺傳學(xué)時代還是在當(dāng)今的基因組學(xué)時代，多線染色體都為遺傳學(xué)尤其是果蠅的遺傳學(xué)研究提供了不少便利，這種便利是其他一些物種通常所不具備的。雙翅目昆蟲多線染色體的原位雜交方法可以確定一條RNA或DNA序列在染色體上位置，將許許多多的DNA序列與果蠅的多線染色體進(jìn)行原位雜交，就可以了解這些序列在果蠅染色體上的順序，進(jìn)而拼接出一長段甚至一條染色體的DNA順序。果蠅的基因組測序就利用了這種方法。而在不具備多線染色體的物種中要拼接DNA序列就困難多了。這就是制備多線染色體至今仍是果蠅

6、遺傳學(xué)研究的基本技術(shù)的原因。唾腺染色體廣泛應(yīng)用于細(xì)胞遺傳學(xué)、發(fā)生遺傳學(xué)、進(jìn)化遺傳學(xué)及分子遺傳學(xué)的研究中。唾腺染色體的制片是研究唾腺染色體的關(guān)鍵步驟，本實驗用壓片法進(jìn)行制片觀察果蠅的唾腺染色體。2.材料和方法2.1 材料、試劑和器材實驗材料：果蠅的三齡幼蟲。實驗試劑：生理鹽水（0.9%NaCI溶液）、蒸餾水、1mol/L HCl、45%乙酸、改良苯酚品紅染液實驗器材：顯微鏡、解剖鏡、兩根解剖針（針尖要尖細(xì)些好）、載玻片、蓋玻片（20mm×20mm）、濾紙條（約0.5mm×3mm）、小毛筆。2.2 方法2.2.1三齡幼蟲的飼養(yǎng)飼養(yǎng)方法一般遵循以下規(guī)則：培養(yǎng)基富含營養(yǎng)。按果蠅培養(yǎng)

7、基配方配制培養(yǎng)基。在一齡幼蟲出現(xiàn)后，每天在培養(yǎng)基表面薄薄地滴上一層用新鮮的酵母或干酵母配成的2%4%的水溶液，作為幼蟲的補充食物，二、三齡幼蟲期則滴加10%左右的酵母液；蟲口密度要小。在一新的培養(yǎng)瓶中接種10對左右親蠅，24小時后即把它們清除，這樣就不會因瓶中蟲口密度太大而影響幼蟲發(fā)育；低溫培養(yǎng)。在1820的低溫下培養(yǎng)最好，25培養(yǎng)也行。2.2.2剝離唾腺要獲得好的實驗結(jié)果，選材是關(guān)鍵。本實驗應(yīng)當(dāng)選擇在培養(yǎng)頻壁上胖胖的稍微有些發(fā)黃的，身體不動，頭時不時微微擺動的三齡幼蟲。這種幼蟲染色體條帶清晰。在一張干凈的載玻片上滴一滴生理鹽水，用小毛筆從果蠅三齡幼蟲培養(yǎng)瓶中選擇適宜的三齡幼蟲置于載玻片上的生

8、理鹽水中。將載玻片置于解剖鏡下，取兩根解剖針，每只手各持一個解剖針，在解剖鏡下進(jìn)行操作。由于果蠅的唾腺位于幼蟲體前1/31/4處，所以左手持解剖針按壓住蟲體前端三分之一的部位，固定幼蟲，右手持解剖針扎住幼蟲頭部口器部位，適當(dāng)用力向右拉唾腺，腺體隨之而出，從而找到唾腺（唾液腺透明，旁邊附著黑色細(xì)長脂肪）。用解剖針去除唾腺以外的組織，再小心剔除唾腺上的脂肪。剝離清楚的唾腺是肉眼可辨的一個很小的白點，看清這個小點有利于下面的操作。2.2.3 解離和染色(1)用HCl解離解離：在唾腺組織上滴一滴1mol/L HCl，解離2-3min ，使組織松軟，利于染色體的分散。解離完畢吸去HCl。水洗：用水沖洗2

9、-3次。前兩次每次 12 分鐘。用濾紙小心吸去多余的蒸餾水。染色：滴加一滴（約25微升）改良苯酚品紅染液，染色5-10分鐘。染色時間不可過長，否則背景也著色。(2)用45%乙酸解離解離：加一滴45%乙酸30s，用濾紙條小心洗凈溶液。水洗：用水沖洗2-3次。前兩次每次 12 分鐘。用濾紙小心吸去多余的蒸餾水。染色：滴加一滴（約25微升）改良苯酚品紅染液，染色5-10分鐘。染色時間不可過長，否則背景也著色。2.2.4壓片染色完成后，將載玻片放在平整的臺板上，蓋上干凈的蓋玻片。蓋前一定要小心地吸去多余的染料。用干凈的濾紙條蓋住蓋玻片的一角，左手壓在濾紙條上按住蓋玻片，右手持解剖針用針尖垂直地、螺旋形

10、由中間向四周輕輕地敲擊蓋玻片，注意不能移動蓋玻片（此步驟可在解剖鏡下觀察）。最后用兩層濾紙覆蓋在蓋玻片上，用兩個拇指垂直用力按壓，按壓時不能讓蓋片滑動，否則會造成染色體的扭斷斷裂。2.2.5鏡檢先用低倍鏡進(jìn)行觀察，尋找染色體臂分散良好的標(biāo)本，找到后將其移至視野中央，換用高倍鏡觀察染色中心、蓬突、橫紋、間紋及根據(jù)臂末端特征辨認(rèn)各條臂。3.結(jié)果3.1 結(jié)果觀察圖1 圖23.2 結(jié)果分析唾腺染色體從染色中心向四周放射狀地伸出5長1短的6條臂。染色中心(箭頭指向)染色質(zhì)連接不緊密，橫紋結(jié)構(gòu)也不明顯。黑腹果蠅的體細(xì)胞染色體數(shù)是8，其中第染色體（X染色體）是端著絲粒染色體，在形成唾腺染色體時，著絲粒附著在

11、染色中心，另一端游離，僅形成一條臂。這條臂的末端有一個永久性的蓬突；第染色體臂非常短，附在染色中心邊緣。第、染色體都是中部著絲點染色體，每條染色體呈“V”形向外伸展出兩條臂，形成2L、2R、3L、3R四條臂。這幾條染色體最容易辨認(rèn)的就是4號染色體和X染色體。4號染色體染色體臂非常短，附在染色中心邊緣；4號染色體末端有一個永久性的蓬突；其他四條染色體不容易辨認(rèn)，但是可以通過以下特征加以區(qū)分：2L和2R染色體較之于3L和3R染色體末端較窄。2L染色體末端有尖尖的突起，橫紋不明顯；2R染色體末端橫紋明顯；3R末端肥大；3L離末端不遠(yuǎn)處有條帶較深的鼓起。也可以根據(jù)染色體的長度來判斷量量配對的染色體。此

12、次呈現(xiàn)的兩張圖中，圖1染色體臂伸展較開，但是清晰度不足，圖2染色體很清晰，但是伸展得不夠開，兩圖可以優(yōu)勢互補。4.討論（1）多線染色體在許多消化道或消化腺的組織中均存在，但觀察多線染色體多用三齡幼蟲的唾腺，這是因為唾腺易于剝?nèi)∏移渲械娜旧w較大的原因。（2）選材時應(yīng)選擇在培養(yǎng)頻壁上胖胖的稍微有些發(fā)黃的，身體不動，頭時不時微微擺動的三齡幼蟲。這種幼蟲染色體條帶清晰。（3）識別唾腺時抓住幾個特征：第一，它是上小下大的囊狀結(jié)構(gòu)，唾腺旁附著帶狀的脂肪，在解剖鏡下（用側(cè)或頂光源照明）可見唾腺是接近透明的結(jié)構(gòu)，而脂肪常呈黑色；第二，唾腺上的細(xì)胞較大，在解剖鏡下依稀可見輪廓，放在顯微鏡的低倍鏡上下調(diào)焦可清楚

13、地看到；第三，唾液腺較透明，而腸子顏色偏黃并且很長，不要將二者混淆。（4）清除唾腺周圍的脂肪組織時要量力而行。（5）剝離唾腺時一定要加生理鹽水，否則唾腺易干。不過生理鹽水的量不可太多，否則果蠅幼蟲會漂浮而且活躍。若生理鹽水較多，要在剝離唾腺前吸走一些，但唾腺剝離后不要吸生理鹽水，以防將唾腺一起吸走。（6）為了避免用濾紙吸溶液（生理鹽水、蒸餾水、HCl或醋酸）時將唾腺吸走，可以用以下方法解決：用濾紙吸去溶液時將載玻片稍傾斜，此時液體順著載玻片往下流，唾腺則會附著在載玻片上。肉眼辨別唾腺的位置，然后在距唾腺一定距離的下游小心地將液體吸走。（7）滴加一滴（約25微升）改良苯酚品紅染液，染色液勿過多，否則壓片時唾腺容易隨染色液漂走溢出玻片外，同時亦不便于壓片的操作，不妨先用一張空白的玻片試驗一下留多少染料合適。染色時若染液干了，應(yīng)再少加些染色液，再慢慢蓋上蓋波片，避免氣泡產(chǎn)生。（8）染色5-10分鐘。染色時間不可過長，否則背景也著色并且橫紋也會不明顯。同時染色時間也不可過短，否則染色太淺橫紋也不明顯。（9）染料若是有黑色雜質(zhì)，要在解剖鏡下觀察雜質(zhì)是否將唾腺覆蓋。如果覆蓋了，要小心剖去雜質(zhì)，盡量不要損害唾腺細(xì)胞。（10）敲片時用干凈的濾紙條蓋住蓋玻片的一角，左手壓在濾紙條上按住蓋玻片，