抗體的制備方法與原理

1、抗體的制備方法與原理一、抗血清的制備有了質(zhì)量好的抗原，還必須選擇適當?shù)拿庖咄緩?，才能產(chǎn)生質(zhì)量好（特異性強和效價高）的抗體。（一）用于免疫的動物作免疫用的動物有哺乳類和禽類，主要為羊、馬、家兔、猴、豬、豚鼠、雞等，實驗室常用者為家兔、山羊和豚鼠等。動物種類的選擇主要根據(jù)抗原的生物學(xué)特性和所要獲得抗血清數(shù)量，如一般制備抗球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因動物反應(yīng)良好，而且能夠提供足夠數(shù)量的血清，用于免疫的動物應(yīng)適齡，健壯，無感染性疾患，最好為/雄性，此外還需十分注意動物的飼養(yǎng)，以消除動物的個體差異以及在免疫過程中死亡的影響。若用兔，最好用純種新西蘭兔，一組三只，兔的體重以2 3kg 為宜。r-免疫（

2、二）免疫途徑免疫途徑有多種多樣，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)內(nèi)注射等，一般常用皮下或背部多點皮內(nèi)注射，每點注射 0.1ml 左右。途徑的選擇決定于抗原的生物學(xué)特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物學(xué)活性抗原，一般不宜采用靜脈注射。（三）佐劑由于不同個體對同一抗原的反應(yīng)性不同，而且不同抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力也有強有弱，因此常常在注射抗原的同時，加入能增強抗原的抗原性物質(zhì)，以刺激機體產(chǎn)生較強的免疫反應(yīng)，這種物質(zhì)稱為免疫佐劑。佐劑除了延長抗原在體內(nèi)的存留時間，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，使參與免疫反應(yīng)的免疫活性細胞增多，促進 T 細胞與 B 細胞的相互作用，

3、從而增強機體對抗原的細胞免疫和抗體的產(chǎn)生。常用的佐劑是福氏佐劑（油的比例，視需要可調(diào)整為卡介苗就成為完全佐劑。Freundadjuvant ）, 其成分通常是羊毛脂1 份、石臘油5 份，羊毛脂與石臘1 ：29 （V/V ），這是不完全福氏佐劑，在每毫升不完全佐劑加入1 20mg配制方法：按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內(nèi)，用超聲波使之混勻，高壓滅菌，置4下保存?zhèn)溆?。免疫前取等容積完全或不完全佐劑與免疫原溶液混合，用振蕩器混勻成乳狀，也可以在免疫前取需要量佐劑置乳缽中研磨，均勻后再邊磨邊滴加入等容積抗原液（其中加卡介苗3 4mg/ml 或不加），加完后再繼續(xù)研磨成乳劑，滴于冰水上5 10min 內(nèi)完

4、全不擴散為止。為避免損失抗原，亦可用一注射器裝抗原液，另一注射器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管連接，然后二者來回反復(fù)抽吸，約數(shù)十分鐘后即能完全乳化。檢查合格后即以其中一注射器作注射用。（四）免疫方法抗原劑量，首次劑量為300 500g，加強免疫的劑量約為首次劑量為1/4 左右。每 2 3 周加強免疫一次。加強免疫時用不完全佐劑，首次免疫時皮下注射百日咳疫苗0.5ml ，加強免疫時不必注射百日咳疫苗。在第 2 次加強免疫后2 周，從耳緣靜脈取2 3ml 血，制備血清，檢測抗體效價（見后）。如未達到預(yù)期效價，需再進行加強免疫，直到滿意時為止（圖 2-3 ）。當抗體效價達到預(yù)期水平時，即可放血制備抗血清

5、。圖 2-3抗體反應(yīng)（五）抗血清的采集與保存家兔是最常用以產(chǎn)生抗體的動物，因此這里主要討論兔血的收集。羊等較大動物以頸靜脈、動脈取血，鼠等小動物取血可參閱有關(guān)資料。取兔血有兩種方法，一是耳緣靜脈或耳動脈放血，一是頸動脈入血，也可心臟采血。取動脈或靜脈放血時，將兔放入一個特造的木匣或籠內(nèi)，耳露于箱（籠）外，也可由另一人捉住兔身。剪去耳緣的毛，用少許二甲苯涂抹耳廓，30s 后，耳血管擴張、充血。用手輕拉耳尖，以單面剃須刀或尖的手術(shù)刀片，快速切開動脈或靜脈，血液即流出，每次可收集30 40ml 。然后用棉球壓迫止血，凝血后洗去二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反復(fù)多次放血。頸動脈放血時，將兔仰

6、臥，固定于兔臺，剪去頸部的毛，切開皮膚，暴露頸動脈，插管，放血。放血過程中要嚴格按無菌要求進行。收集的血液置于室溫下 1h 左右，凝固后，置 4下，過夜（切勿冰凍）析出血清，離心， 0min 。在無菌條件，吸出血清，分裝（ 0.05 0.2ml ），貯于 -40 以下冰箱，或凍干后貯存于4000rpm,14。C 冰箱保存。（六）抗血清質(zhì)量的評價在免疫期間，不僅各個不同的動物，而且同一動物在不同的時間內(nèi)抗血清效價、特異性、親合力等都可能發(fā)生變化，因而必須經(jīng)常地采血測試。只有在對抗血清的效價、特異性、親合力等方面作徹底的評價后，才可使用所取得的抗血清。1效價抗血清的效價，就是指血清中所含抗體的濃度

7、或含量。效價測定的方法常用的是放射免疫法，此法對所有的抗體均適用。某些由大分子（如蛋白類）抗原所產(chǎn)生的抗體，可用雙擴散等方法測定。前者測定的效價極為精確。而后者則粗糙得多。（ 1）放射免疫法：以不同稀釋度的抗血清與優(yōu)質(zhì)標記抗原混合，孵育24h 后，測定其結(jié)合率。通常以結(jié)合率為50% 的血清稀度和為效價。如某抗血清的結(jié)合率為50% 時的稀釋度為1 ：15000 ，則該血清的效價就是 1 ：15000 ?？寡宓男r，除由抗血清本身的性質(zhì)決定外，還受標記抗原的質(zhì)量、孵育時間，所用稀釋液的成分及其pH 等因素的影響，在工作中必須引起注意。（測定方法見第8 章）（ 2 ）雙向擴散法：利用大分子抗原和抗

8、體在瓊脂平板上擴散，兩者在相交處產(chǎn)生沉淀線，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。球脂板的制備： 100mlpH7.1的磷酸鹽緩沖液加到15g 的瓊脂內(nèi)，于水浴中加溫，攪拌，使瓊脂完全溶解，趁熱用紗布過濾，待溶液冷卻到65 左右時， 加入疊氮鈉 （ NaN3 ），使其在溶液中的濃度為0.1% 。用移液管把瓊脂放在干凈平皿或玻片上，約3mm 厚，待其冷卻，完全凝固后，用打孔器打孔（圖2-4）。中央孔內(nèi)加適量抗原（容量為50l），周圍各孔內(nèi)分別加入50l 1：2、 1： 4 、1： 8、 1：16 、1 ： 32 及不稀釋的抗血清，37下孵育24h ，觀察有無沉淀線產(chǎn)生，以判斷血清的稀釋度（圖2

9、-5）。圖 2-4 雙向擴散模型圖 2-5 免疫擴散試驗2特異性測定抗血清的特異性或稱專一性是指抗血清對相應(yīng)的抗原及近似的抗原物質(zhì)的識別能力。特異性好就是抗血清的識別能力強。通常，特異性是以交叉反應(yīng)率來表示的。交叉反應(yīng)率低，表示抗血清的特異性好，反之則特異性差。交叉反應(yīng)率一般是用競爭抑制曲線來判斷的。以不同濃度的抗原和近似抗原物質(zhì)分別做競爭抑制曲線，計算各自的結(jié)合率（ B/T 或 B/B0 ），求出各自在 IC50 時的濃度，按下列公式計算交叉反應(yīng)率。S=y/Z×100%S ：交叉反應(yīng)率，y：IC50 時抗原濃度， Z ：IC50 時近似抗原物質(zhì)的濃度。如某抗原的IC50 濃度為 9

10、0Pg/ 管，而一些近似抗原物質(zhì)IC50 濃度幾乎是無限大，可以說這一抗血清與其它抗原物質(zhì)的交叉反應(yīng)率近似零，即無交叉反應(yīng)，該抗血清的特異性是好的。3親合力在免疫學(xué)中，親合力是指抗體與結(jié)合抗原體的活度或牢固度?？贵w與抗原結(jié)合疏松，結(jié)合后會迅速解離，稱為親合力低，反之，親合力高。親合力的高低是由抗原分子的大小，抗體分子的結(jié)合位點與抗原的決定基之間的立體結(jié)構(gòu)型的合適程度決定的。親合力常以親合常數(shù)K 表示。 K 的單位是升 /摩爾（ L/mol ）。在 RIA 中， K 是該抗血清能達到的最小檢出量（靈敏度）的倒數(shù)，K=1/H ， H 是最小檢出量，通常， K 的范圍在 108 1012L/mol之

11、間，也有高達1014L/mol的。計算親合常數(shù)的方法20 余種，計算出的K 都不能真實反映實驗情況，只能作為參考。（七）免疫失敗的可能原因及應(yīng)采取的措施有時不能獲得滿意的抗血清，可從下列幾方面找原因，并改進之。（1 ）免疫動物的種屬及品系是否合適，可考慮改變動物的種屬或品系，或擴大免疫動物的數(shù)量。（ 2）抗原質(zhì)量是否良好，可改用其它廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其它批號，也可考慮改變抗原分子的部分結(jié)構(gòu)，或改進提取方法。（ 3 ）制備的免疫原是否符合要求， 可從偶聯(lián)劑， 載體、抗原或載體的比例、 反應(yīng)時間等多方面去考慮，并加以改進。（ 4 ）所用的佐劑是否合適，乳化是否完全，可改用其它佐劑，或加強乳

12、化。（ 5 ）免疫的方法、劑量，加強免疫的間隔時間和次數(shù)，免疫的途徑是否合適。（ 6 ）動物的飼養(yǎng)是否得當，如營養(yǎng)（飼料、飲水）、環(huán)境衛(wèi)生（通風、采光、溫度）是否符合要求，動物的健康情況是否良好等。二、單克隆抗體的制備1975 年 Kohler 和 Milstein 發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細胞與和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合，形成的雜交瘤細胞既可產(chǎn)生抗體，又可無性繁殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破使血清學(xué)的研究進入了一個高度精確的新紀元。免疫細胞化學(xué)的技術(shù)關(guān)鍵之一是制備特異性強、親合力大、滴度高的特異性抗體，由于每種抗原都有幾個抗原決定簇，用它免疫動物將產(chǎn)生對各個決定簇的抗

13、體，即多克隆抗體。單克隆抗體則是由一個產(chǎn)生抗體的細胞與一個骨髓瘤細胞融合而形成的雜交廇細胞經(jīng)無性繁殖而來的細胞群所產(chǎn)生的，所以它的免疫球蛋白屬同一類型，質(zhì)地純一，而且它是針對某一抗原決定簇的，因此特異性強，親合性也一致。單克隆抗體（ McAb ）的特性和常規(guī)血清抗體的特性比較見2-3。表 2 3 單克隆抗體（ McAb ）和常規(guī)免疫血清抗體的特性比較項目常規(guī)免疫血清抗體McAb抗體產(chǎn)生細胞多克隆性單克隆性抗體的結(jié)合力特異性識別多種抗原決定簇特異性識別單一抗原決定簇免疫球蛋白類別及亞類不均一性，質(zhì)地混雜同一類屬，質(zhì)地純一特異性與親合力批與批之間不同特異性高，抗體均一0.5 5.0mg/ml( 小

14、鼠腹水 )有效抗體含量0.01 0.1mg/ml （小鼠腹水）0.5 10.0 g/ml（培養(yǎng)物上清液）用于常規(guī)免疫學(xué)實驗可用單抗組合應(yīng)用抗原抗體形成格子結(jié)構(gòu) （沉淀容易形成一般難形成反應(yīng)）抗體混雜，形成2 分子反應(yīng)困難，抗原抗體反應(yīng)可形成 2 分子反應(yīng)，可逆不可逆單克隆抗體的制備方法如下。（一）動物的選擇與免疫1動物的選擇純種 BALB/C 小鼠，較溫順，離窩的活動范圍小，體弱，食量及排污較小，一般環(huán)境潔凈的實驗室均能飼養(yǎng)成活。目前開展雜交瘤技術(shù)的實驗室多選用純種BALA/C 小鼠。2免疫方案選擇合適的免疫方案對于細胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb 至關(guān)重要。一般在融合前兩個月左右根據(jù)

15、確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。（ 1 ）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應(yīng)先制備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑。初次免疫抗原 1 50g加福氏完全佐劑皮下多點注射或脾內(nèi)注射（一般0.8 1ml,0.2ml/ 點）3 周后第二次免疫劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip（腹腔內(nèi)注射）（ip 劑量不宜超過0.5ml ）3 周后第三次免疫劑量同一，不加佐劑，ip（5 7 天后采血測其效價） 23 周加強免疫，劑量50 500g為宜， ip 或 iv（靜脈內(nèi)注射） 3 天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷

16、有所更新，如：將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷环矫嬖鰪娏丝乖拿庖咴?，另一方面可降低抗原的使用量。改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。使用細胞因子作為佐劑，提高機體的免疫應(yīng)答水平，增強免疫細胞對抗原的反應(yīng)性。（ 2 ）顆?？乖庖咝詮?，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細胞性抗原為例，免疫時要求抗原量為 1 2×107 個細胞。初次免疫1×107/0.5mlip2 3 周后第二次免疫1×107/0.5mlip3 周后加強免疫（融合前三天）1×107/0.5mlip 或 iv取脾融合（二）細胞融合1細胞融合前準備（ 1 ）骨髓瘤細胞系的選擇：骨

17、髓瘤細胞應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb 。常用的骨髓瘤細胞系見表2-4。表 2-4 用于融合試驗的主要骨髓瘤細胞系Ig 鏈名 稱來 源耐受藥物H LBALB/C骨髓瘤P3/X63-Ag8(X63)8- 氮鳥嘌呤r1 KMOPC-21P3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653)P3/X63-Ag88- 氮鳥嘌呤 P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1)P3/X63-Ag88- 氮鳥嘌呤 K （不分泌型）（ X63×BALB/C脾 細P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul)8- 氮鳥嘌呤 胞）雜交瘤（ X63

18、15;BALB/C 脾 細SP2/0-Ag14(SP2/0)8- 氮鳥嘌呤 胞）雜交瘤F0BALB/C骨髓瘤8- 氮鳥嘌呤 S194/5.XXO.BU.1P3/X63-Ag85- 溴脫氧尿嘧啶核苷 BALB/C骨髓瘤MPC11-45.6TG1.76- 巰鳥嘌呤r2bKMPC-11210.RCY3.Ag1.2.3LOU 大鼠骨髓瘤 R2108- 氮鳥嘌呤KGM15006TG-A12人骨髓瘤 GM15006- 巰鳥嘌呤r1KU-266AR人骨髓瘤 U-2668- 氮鳥嘌呤骨髓瘤細胞的培養(yǎng)可用一般的培養(yǎng)液，如 RPMI1640 ，DMEM 培養(yǎng)基。 小牛血清的濃度一般在10% 20% ，細胞濃度以1

19、04 5×105/ml 為宜，最大濃度不得超過106/ml 。當細胞處于對數(shù)生長的中期時，可按1：3 1：10 的比例傳代。每35 天傳代一次。細胞在傳代過程中，部分細胞可能有返祖現(xiàn)象，應(yīng)定期用8- 氮鳥嘌呤進行處理，使生存的細胞對HAT 呈均一的敏感性。（2 ）飼養(yǎng)細胞：在組織培養(yǎng)中，單個或少數(shù)分散的細胞不易生長繁殖，若加入其它活細胞，則可促進這些細胞生長繁殖，所加入的這種細胞數(shù)被稱為飼養(yǎng)細胞。在制備McAb 的過程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細胞，如在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞（較為常用）、小鼠脾臟細胞或胸腺細胞

20、。也有人用小鼠成纖維細胞系3T3 經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細胞。飼養(yǎng)細胞的量為一般為2×104 或 105 細胞 / 孔。2細胞融合的步驟（1 ）制備飼養(yǎng)細胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細胞。與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C 小鼠， 6 10 周拉頸處死，浸泡在75% 酒精內(nèi)， 3 5min用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜用無菌注射器注入5 6ml 預(yù)冷的培養(yǎng)液（嚴禁刺破腸管）反復(fù)沖洗，吸出沖洗液沖洗液放入10ml 離心管， 1200rpm/ 分離 5 6min用 20% 小牛血清（ NCS ）或胎牛血清（FCS ）的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細胞數(shù)至1×105/ml加入 96 孔板

21、， 100l/孔放入 37 。 c CO2 孵箱培養(yǎng)（2 ）制備免疫脾細胞最后一次加強免疫3 天后小鼠拉頸處死無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗一次脾臟研碎，過不銹鋼篩網(wǎng)離心，細胞用培養(yǎng)液洗2 次計數(shù)取 108 脾淋巴細胞懸液備用（3 ）制備骨髓瘤細胞取對數(shù)生長骨髓瘤細胞離心用無血清培養(yǎng)液洗 2 次計數(shù)，取得× 107 細胞備用（4 ）融合將骨髓瘤細胞與脾細胞按1 ：10 或 1 ：5 的比例混合在一起，在50ml 離心管中用無血清不完全培養(yǎng)液洗 1 次，離心， 1200rpm,8min;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG ）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略松動。90s 內(nèi)加

22、入 37 預(yù)溫的1ml 45%PEG （分子量 4000 ）溶液，邊加邊輕微搖動。 37 水浴作用90s 。加 37 。 C 預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG 作用，每隔2min 分別加入1ml 、2ml 、3ml 、 4ml 、5ml和 6ml 。離心， 800rpm,6min 。充上清，用含20% 小牛血清HAT 選擇培養(yǎng)液重懸。將上述細胞，加到已有飼養(yǎng)細胞層的96 孔板內(nèi)，每孔加 100l。一般一個免疫脾臟可接種4塊96孔板。將培養(yǎng)板置37 、 5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（三）選擇雜交瘤細胞及抗體檢測1 HAT 選擇雜交瘤細胞 脾細胞和骨髓瘤細胞經(jīng) PEG 處理后，形成多種細胞的混合體，只

23、有脾細胞與骨髓細胞形成的雜交瘤細胞才有意義。 在 HAT 選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)時， 由于骨髓瘤細胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶， 故不能生長繁殖， 而雜交瘤細胞具有上述兩種酶，在 HAT 選擇培養(yǎng)液可以生長繁殖。在用 HAT 選擇培養(yǎng)1 2 天內(nèi)，將有大量瘤細胞死亡，3 4 天后瘤細胞消失，雜交細胞形成小集落，HAT 選擇培養(yǎng)液維持710 天后應(yīng)換用 HT 培養(yǎng)液，再維持 2 周，改用一般培養(yǎng)液。 在上述選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細胞布滿孔底1/10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。在選擇培養(yǎng)期間，一般每 2 3天換一半培養(yǎng)液。2抗體的檢測檢測抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性

24、質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。常用的方法有：（1）放射免疫測定（RIA ）可用于可溶性抗原、細胞McAb 的檢測。（ 2）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ ELISA ）可用于可溶性抗原、細胞和病毒等 McAb 的檢測。（ 3）免疫熒光試驗適合于細胞表面抗原的 McAb 的檢測。（ 4）其它如間接血凝試驗、細胞毒性試驗、旋轉(zhuǎn)粘附雙層吸附試驗等。（四）雜交瘤的克隆化雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。因為經(jīng)過 HAT 篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內(nèi)只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數(shù)個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞、所需要

25、的抗體（特異性抗體）分泌細胞和其它無關(guān)抗體的分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開就需要克隆化。克隆化的原則是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制，因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結(jié)果會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力?？寺』姆椒ê芏?，最常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法。1有限稀釋法克?。? ）克隆前 1 天制備飼養(yǎng)細胞層（同細胞融合）。2）將要克隆的雜交瘤細胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹干，計數(shù)。（3 ）調(diào)整細胞為3 10 個細胞

26、/ml 。（4 ）取頭天準備的飼養(yǎng)細胞層的細胞培養(yǎng)板，每孔加入稀釋細胞100l。孵育于 37 、 5%CO2 孵箱中 。（ 5 ）在第 7 天換液，以后每 23 天換液 1 次。（ 6 ）89 天可見 細胞克隆形成，及時檢測抗體活性。（ 7 ）將陽性孔的細胞移至 24 孔板中擴大培養(yǎng)。（ 8 ）每個克隆應(yīng)盡快凍存。2軟瓊脂培養(yǎng)法克?。? ）軟瓊脂的配制：含有20%NCS （小牛血清）的2 倍濃縮的RPMI1640 。1% 瓊脂水溶液：高壓滅菌，42 預(yù)熱。0.5% 瓊脂：由1 份 1%瓊脂加 1 份含 20% 小牛血清的2 倍濃縮的 RPMI1640配制而成。置42 保溫。（ 2 ）用上述 0

27、.5% 瓊脂液（含有飼養(yǎng)細胞） 15ml 傾注于直徑為 9cm 的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。（ 3 ）按 100/ml ，500/ml 或 5000/ml 等濃度配制需克隆的細胞懸液。（ 4 ）1ml 0.5% 瓊脂液（ 42預(yù)熱）在室溫中分別與 1ml 不同濃度的細胞懸液相混合。（5 ）混勻后立傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10min ，使其凝固，孵育于37 、 5%CO2 孵箱中。（ 6 ）4 5 天 后即可見針尖大小白色克隆，7 10 天后，直接移種至含飼養(yǎng)細胞的24 孔中進行培養(yǎng)。（ 7 ）檢測抗體，擴大培養(yǎng)，必要是地再克隆化。（五）雜交瘤細胞的凍存與復(fù)蘇1雜交瘤細胞的凍存

28、及時凍存原始孔的雜交瘤細胞每次克隆化得到的亞克隆細胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩(wěn)定分泌抗體的細胞系的時候，細胞的培養(yǎng)過程中隨時可能發(fā)生細胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存，則可因上述意外而前功盡棄。雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞系的凍存方法一樣，原則上細胞應(yīng)在每支安瓿含1×106 以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在 24 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當長滿孔底時， 一孔就可以裝一支安瓿凍存。細胞凍存液： 50% 小牛血清； 40% 不完全培養(yǎng)液；10%DMSO （二甲基亞砜）。凍存液最好預(yù)冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降至 0后放入

29、-70 超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。 也可用細胞凍存裝置進行凍存。 凍存細胞要定期復(fù)蘇， 檢查細胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細胞可保存數(shù)年或更長時間。2細胞復(fù)蘇方法將玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37 水浴中，在1min內(nèi)使凍存的細胞解凍，將細胞用完全培養(yǎng)液洗滌兩次，然后移入頭天已制備好的飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37、 5%CO2孵箱中培養(yǎng)，當細胞形成集落時，檢測抗體活性。（六）單克隆抗體的大量生產(chǎn)大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：（ 1 ）體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細胞，從一清液中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液內(nèi)抗體含量為 10 60g/ml, 如果大量生產(chǎn)，費用較高。（ 2 ）體內(nèi)接種雜交瘤細胞，制備腹水或血清。實體瘤法： 對數(shù)生長期的雜交瘤細胞按1 3×107/ml 接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml