X射線晶體衍射測(cè)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)PPT課件

1、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定2011-3-30蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)測(cè)定方法及數(shù)量蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)測(cè)定年增長圖第一節(jié)：第一節(jié)：X-射線衍射技術(shù)用于蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定射線衍射技術(shù)用于蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定n原理n基本過程基本過程n優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn)n應(yīng)用實(shí)例應(yīng)用實(shí)例一、相關(guān)原理n光的衍射現(xiàn)象nX射線的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用n本質(zhì)的爭(zhēng)論nX射線衍射的發(fā)現(xiàn)n晶體學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)nX射線晶體衍射?S光線光線拐彎了！拐彎了！1.1.光的衍射光的衍射現(xiàn)象現(xiàn)象ESES當(dāng)縫的大小（或障礙物的大?。└ㄩL相差不多時(shí)就發(fā)生明顯的衍射現(xiàn)象如果縫很寬，其寬度遠(yuǎn)大于波長，則波通過縫后基本上是沿直線傳播的，衍射現(xiàn)象就很不明顯了 惠更斯惠更斯菲涅耳原理菲涅耳原

2、理菲涅耳菲涅耳補(bǔ)充：從同補(bǔ)充：從同一波陣面上各點(diǎn)發(fā)一波陣面上各點(diǎn)發(fā)出的子波是相干波。出的子波是相干波。 1818年年惠更斯：惠更斯：光波陣面光波陣面上每一點(diǎn)都可以看上每一點(diǎn)都可以看作新的子波源，以作新的子波源，以后任意時(shí)刻，這些后任意時(shí)刻，這些子波的包跡就是該子波的包跡就是該時(shí)刻的波陣面。時(shí)刻的波陣面。 1690年年解釋不了光強(qiáng)分布！解釋不了光強(qiáng)分布！ 2. X射線的發(fā)現(xiàn)歷程及應(yīng)用n失之交臂q1836 法拉第 發(fā)現(xiàn)陰極射線q1861 克魯克斯 陰極射線管在放電時(shí)會(huì)產(chǎn)生亮光 干版和光片有問題？q1890 古德斯柏德 洗出了一張X射線的透視底片 照片的沖洗藥水或沖洗技術(shù) n發(fā)現(xiàn)X射線n本質(zhì)的爭(zhēng)論n

3、X射線衍射2.X射線的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用n1895年 倫琴（Roentgen）發(fā)現(xiàn)故稱為倫琴射線。倫琴夫人的手的X射線照片X射線在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用n倫琴的新發(fā)現(xiàn)轟動(dòng)了全世界, 不到三個(gè)月, 維也納的一家醫(yī)院便拍出了應(yīng)用于醫(yī)療的X射線照片.從此, X射線拍片和射線透視成為醫(yī)學(xué)診療中常用的手段。n為了防止各臟器成像發(fā)生的重疊給診療帶來不便, 科學(xué)家們進(jìn)一步研究了成像更清晰、靈敏度更高的儀器。1972年，英國科學(xué)家漢斯菲爾德運(yùn)用計(jì)算機(jī)和圖像重建理論, 制成了電子計(jì)算機(jī)射線斷層掃描成像裝置, 也就是已被廣泛應(yīng)用的CT。X射線與諾貝爾獎(jiǎng)物理學(xué)獎(jiǎng)n倫琴因發(fā)現(xiàn)X射線而獲得第一屆諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。n1903 年諾貝爾物理學(xué)

4、獎(jiǎng)。n1906 年的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。n勞厄獲得了1914 年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。n英國的布拉格父子1915 年的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。n英國的巴克拉1917 年的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。n瑞典物理學(xué)家西格班1924 年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。n美國的康普頓1927 年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。n前蘇聯(lián)的切連科夫1958 年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng);n美國的霍夫斯塔特1961 年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng);n瑞典的西格巴恩1981 年的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)?；瘜W(xué)獎(jiǎng)n荷蘭的物理化學(xué)家德拜1936 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。n美國著名化學(xué)家鮑林1954 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。n英國生物學(xué)家肯德魯與佩魯茨1962 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。n英國女化學(xué)家霍奇金1964 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。n美

5、國化學(xué)家利普斯科姆1976 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。n英國化學(xué)家桑格和美國化學(xué)家吉爾伯特1980 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。n英國生物化學(xué)家克盧格因1982 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng); n美國化學(xué)家豪普特曼和卡爾1985 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng);n1988 年,米歇爾等三位德國生物化學(xué)家諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。3.X射線本質(zhì)的爭(zhēng)論X射線本質(zhì)的爭(zhēng)論-波動(dòng)說巴克拉： X射線波動(dòng)性 標(biāo)識(shí)譜線：不管元素已化合成什么化合物，它們總是發(fā)射一種硬度的X射線，當(dāng)原子量增大時(shí)，標(biāo)識(shí)X射線的穿透本領(lǐng)會(huì)隨著增大。這說明X射線具有標(biāo)識(shí)特定元素的特性。X射線本質(zhì)的爭(zhēng)論微粒說X射線微粒論者 粒子具有旋轉(zhuǎn)性 布拉克父子4.X射線衍射X射線衍射的獲得n波長范圍：100.

6、1埃n欲觀察其衍射現(xiàn)象則衍射線度應(yīng)與其波長差不多，晶體的晶格常數(shù)恰是這樣的線度n衍射波的兩個(gè)基本特征衍射線（束）在空間分布的方位（衍射方向）和強(qiáng)度與晶體內(nèi)原子分布規(guī)律（晶體結(jié)構(gòu)）密切相關(guān)。nX射線晶體結(jié)構(gòu)分析？射線晶體結(jié)構(gòu)分析？ 使用X射線作為物理工具，依賴X射線衍射現(xiàn)象為物理原理，以晶體作為研究對(duì)象，晶體結(jié)構(gòu)作為研究結(jié)果的一種分析方法。5.X射線的獲得：X射線管激光等離子體同步輻射X射線激光6.晶體基礎(chǔ)n什么是晶體n晶體的周期排布n晶體的對(duì)稱性3.1什么是晶體n固體物質(zhì)q晶體n相當(dāng)罕見的東西？q非晶體n晶體晶體(Crystal )指離子、原子或分子這些微粒在三維空間中周期性重復(fù)排列形成的、能

7、夠給出明銳衍射的固體結(jié)構(gòu)。 晶體什么樣（1）晶體什么樣（2）晶體什么樣（3）晶體什么樣（4）2.晶體和點(diǎn)陣結(jié)構(gòu)n晶體的周期性結(jié)構(gòu)使得我們可以把它抽象成“點(diǎn)陣”來研究. q一維周期性結(jié)構(gòu)與直線點(diǎn)陣一維周期性結(jié)構(gòu)與直線點(diǎn)陣q二維周期性結(jié)構(gòu)與平面點(diǎn)陣二維周期性結(jié)構(gòu)與平面點(diǎn)陣q三維周期性結(jié)構(gòu)與空間點(diǎn)陣三維周期性結(jié)構(gòu)與空間點(diǎn)陣一維周期性結(jié)構(gòu)與直線點(diǎn)陣一維周期性結(jié)構(gòu)與直線點(diǎn)陣 二維周期性結(jié)構(gòu)與平面點(diǎn)陣二維周期性結(jié)構(gòu)與平面點(diǎn)陣三維周期性結(jié)構(gòu)與空間點(diǎn)陣三維周期性結(jié)構(gòu)與空間點(diǎn)陣 n晶胞晶胞(Unit cell)空間點(diǎn)陣的單位（大小和形狀完全相同的平行六面體），是晶體結(jié)構(gòu)的最小單位。同一個(gè)空間點(diǎn)陣，劃分平行六面體

8、的方式是多種多樣的。同一個(gè)空間點(diǎn)陣，劃分平行六面體的方式是多種多樣的。n選擇平行六面體的選擇平行六面體的原則原則：q所選平行六面體的對(duì)稱性應(yīng)符合整個(gè)空間點(diǎn)陣的對(duì)稱性。所選平行六面體的對(duì)稱性應(yīng)符合整個(gè)空間點(diǎn)陣的對(duì)稱性。q 選擇棱與棱之間直角關(guān)系為最多的平行六面體選擇棱與棱之間直角關(guān)系為最多的平行六面體q 所選平行六面體之體積應(yīng)最小。所選平行六面體之體積應(yīng)最小。 q 當(dāng)對(duì)稱性規(guī)定棱間的交角不能為直角關(guān)系時(shí)，應(yīng)選擇結(jié)點(diǎn)間距當(dāng)對(duì)稱性規(guī)定棱間的交角不能為直角關(guān)系時(shí)，應(yīng)選擇結(jié)點(diǎn)間距小的行列作為平行六面體的棱，且棱間的交角接近于直角的平行六小的行列作為平行六面體的棱，且棱間的交角接近于直角的平行六面體。面體

9、。單位平行六面體，單位平行六面體，a、b、c 、 、 、 是表征它本身形狀、是表征它本身形狀、大小的一組參數(shù)，稱為大小的一組參數(shù)，稱為格子參數(shù)或點(diǎn)陣參數(shù)格子參數(shù)或點(diǎn)陣參數(shù)。cab 單位平行六面體參數(shù)單位平行六面體參數(shù)單位平行六面體與坐標(biāo)軸的關(guān)系：棱交角單位平行六面體與坐標(biāo)軸的關(guān)系：棱交角坐標(biāo)軸之間坐標(biāo)軸之間交角交角。 a、b、c 軸單位軸單位。a、b、c、 、 、 關(guān)系有關(guān)系有七種情況七種情況，與單位平行六面體，與單位平行六面體七種格七種格子相對(duì)應(yīng)子相對(duì)應(yīng)。 a=b=c = = =90o a=b=c = = 90o， 60， 109o2816 a=b c = = =90o a=bc = =90

10、o =120o a b c = = =90o a b c = =90o 90o a b c 90o按結(jié)點(diǎn)位置，可有按結(jié)點(diǎn)位置，可有四種四種不同的類型：不同的類型：P 原始格子原始格子（角頂角頂）C 底心格子底心格子（角頂、頂?shù)酌娼琼敗㈨數(shù)酌妫㊣ 體心格子體心格子（角頂、體心角頂、體心）F 面心格子面心格子（角頂、每個(gè)面角頂、每個(gè)面）P 原始格子原始格子（角頂角頂）C 底心格子底心格子（角頂、頂?shù)酌娼琼?、頂?shù)酌妫㊣ 體心格子體心格子（角頂、體心角頂、體心）F 面心格子面心格子（角頂、每個(gè)面角頂、每個(gè)面）結(jié)構(gòu)中代表各類等同點(diǎn)的結(jié)點(diǎn)在空間的排列方式來說，結(jié)構(gòu)中代表各類等同點(diǎn)的結(jié)點(diǎn)在空間的排列方式來說

11、，格子的種類有、且只有十四種。格子的種類有、且只有十四種。衍射方向二、X射線晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定基本過程蛋白質(zhì)獲?。ㄌ峒儯┚w生長并經(jīng)冷凍技術(shù)處理重原子衍生物制備衍射數(shù)據(jù)收集衍生數(shù)據(jù)分析和改進(jìn)結(jié)構(gòu)模型的獲取（包括修正） （2）晶體生長過程及影響因素n晶核（盡量少）n微晶（可用作晶種）n晶體在數(shù)小時(shí)至數(shù)月后出現(xiàn)n2個(gè)問題：是鹽晶嗎？能給出有用的衍射嗎？（多晶/雙晶）n影響因素影響因素v物理因素：溫度、壓力、震動(dòng)、溶劑清潔度、試劑純度、重力、外加物理場(chǎng)等v生物化學(xué)因素：pH、離子強(qiáng)度、沉淀劑/添加劑的類型和濃度等v其他：溶液過飽和度、純度等“經(jīng)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)” “機(jī)器人機(jī)器人”（2）晶體生長過程及影響因素（3）結(jié)

12、晶方法）結(jié)晶方法n批量結(jié)晶法 batch crystallizationn透射法 crystallization by dialysisn液相擴(kuò)散法 liquid diffusionn氣相擴(kuò)散法vapor diffusionn氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)Enhanced amidehydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry, DXMSn生物玻璃bioglass（4）晶體的初步鑒定小分子晶體小分子晶體蛋白質(zhì)晶體蛋白質(zhì)晶體邊界邊界完整，漂亮常不完整，易出現(xiàn)多晶硬度硬度偏硬，易碎成2瓣或幾瓣偏軟，易碎成粉脫水脫水不變化因脫水而變壞溶解性溶解性慢快偏光性偏光性強(qiáng)相對(duì)

13、弱染色性染色性弱強(qiáng)漂浮性漂浮性下沉漂浮（5）衍射數(shù)據(jù)收集）衍射數(shù)據(jù)收集n晶體的處理：低溫液氮?dú)饫淞骷夹g(shù)n數(shù)據(jù)收集儀：底片、面探測(cè)器衍射分析儀器的發(fā)展n射線種類：連續(xù)射線 特征射線 電子衍射 中子衍射 探測(cè)技術(shù)：膠片 閃爍體計(jì)數(shù)器（點(diǎn)） （IP）CCD探測(cè)器（面） 圖圖2-22 2-22 石英的衍射儀計(jì)數(shù)器記錄圖（部分）石英的衍射儀計(jì)數(shù)器記錄圖（部分）*右上角為石英的德拜圖，衍射峰上方為（hkl）值，代表K衍射底片（外森堡相機(jī)、徘循相機(jī)）n優(yōu)點(diǎn)：多點(diǎn)同時(shí)收集容易保存價(jià)格便宜q缺點(diǎn)o存在“化學(xué)霧”背景和X射線散射背景o費(fèi)時(shí)、費(fèi)力計(jì)數(shù)管（四圓衍射儀）n將X射線光子強(qiáng)度轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，信號(hào)放大后再轉(zhuǎn)換成

14、數(shù)字存入計(jì)算機(jī)隨時(shí)調(diào)用n逐點(diǎn)收集數(shù)據(jù)n優(yōu)缺點(diǎn)與底片相反面探技術(shù)-SMART APEX-CCD衍射儀衍射儀Smart CCD OverviewSMART APEX-CCD探測(cè)器探測(cè)器n金屬絲構(gòu)成的面板，可同時(shí)多點(diǎn)收集n將X射線光子強(qiáng)度轉(zhuǎn)換為電信號(hào)n集計(jì)數(shù)管的精確和底片的多點(diǎn)收集效率面探技術(shù)-SMART APEX-CCD衍射儀衍射儀圖像板image platen面探測(cè)器的改進(jìn)n由化學(xué)材料構(gòu)成，整塊板子密度一致n高分辨率n可見光下可測(cè)量n集底片和面探測(cè)器的優(yōu)點(diǎn)于一身（6）數(shù)據(jù)分析n電子密度修飾n電子密度圖詮釋n結(jié)構(gòu)模型精化數(shù)據(jù)處理軟件：Denzo, Scalepack三、X射線晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定優(yōu)點(diǎn)n分辨

15、率高n不損傷樣品n無污染n相對(duì)快捷n能得到晶體完整性的大量信息n晶體構(gòu)象是靜態(tài)的，不能測(cè)定不穩(wěn)定的過渡態(tài)的構(gòu)象；n很多蛋白質(zhì)很難結(jié)晶，或者很難得到用于結(jié)構(gòu)分析的足夠大的單晶；（瓶頸）nX射線晶體衍射的工作流程較長。 四、X射線晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定存在問題Last update: Tuesday Oct 20, 2009 at 5 PM PDTn于1971年和1972年分別得到分辨率為2.5埃和1.8埃的豬胰島素晶體測(cè)定，這是中國闡明的第一個(gè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。豬胰島素(蛋白質(zhì)編號(hào)4ins)的兩條小鏈“中國蛋白質(zhì)晶體學(xué)研究水平和世界發(fā)達(dá)國家一樣高！胰島素晶體最好的電子密度圖在北京，不在牛津?！?多蘿西霍奇金 ，1972五、應(yīng)用實(shí)例五、應(yīng)用實(shí)例1.胰島素2.菠菜捕光蛋白LHC II（膜、疏水，2.72）Nature, 2004, Mar.LHC-IILHC-II是綠色植物中含量最豐富的主要捕光復(fù)合物，這種復(fù)雜的分子體系鑲嵌在生物膜中，具有很強(qiáng)的疏水性，難以分離和結(jié)晶。對(duì)其晶體結(jié)構(gòu)的測(cè)定是國際公認(rèn)的高難課