waters_e2695_training

1、-中心實(shí)驗(yàn)室 唐翠娥Waters High Performance Liquid Chromatography（HPLC） Training52341目目 錄錄HPLC 基礎(chǔ)知識(shí)簡(jiǎn)介基礎(chǔ)知識(shí)簡(jiǎn)介 HPLC 系統(tǒng)組成部件系統(tǒng)組成部件 軟件操作軟件操作 Waters e2695實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作常見(jiàn)色儀器和色譜圖故障常見(jiàn)色儀器和色譜圖故障正相色譜法反相色譜法固定相極性高低中低流動(dòng)相極性低中中高組分洗脫次序極性小先洗出極性大先洗出適用范圍溶于有機(jī)溶劑的極性至中等極性的分子型化合物較廣，非極性至中等極性的組分表表1.1.正相色譜法與反相色譜法比較表 HPLC 基礎(chǔ)知識(shí)簡(jiǎn)介基礎(chǔ)知識(shí)簡(jiǎn)介3HPLC 基礎(chǔ)知識(shí)

2、簡(jiǎn)介基礎(chǔ)知識(shí)簡(jiǎn)介Chromatogram3HPLC 基礎(chǔ)知識(shí)簡(jiǎn)介基礎(chǔ)知識(shí)簡(jiǎn)介PeakPeak BasePeak HeightPeak WidthPeak Width at Half HeightPeak AreaTailing Peak: 后沿較前沿平緩的不對(duì)稱(chēng)峰后沿較前沿平緩的不對(duì)稱(chēng)峰Leading Peak:前沿較后沿平緩的不對(duì)稱(chēng)峰前沿較后沿平緩的不對(duì)稱(chēng)峰Ghost Peak: 假峰假峰BaselineBaseline Drift:Baseline Noise:Band Broadening:組分在色譜柱組分在色譜柱內(nèi)移動(dòng)過(guò)程中譜帶寬度增加的現(xiàn)象內(nèi)移動(dòng)過(guò)程中譜帶寬度增加的現(xiàn)象。色譜圖名詞術(shù)

3、語(yǔ)色譜圖名詞術(shù)語(yǔ)3HPLC 基礎(chǔ)知識(shí)簡(jiǎn)介基礎(chǔ)知識(shí)簡(jiǎn)介3HPLC 基礎(chǔ)知識(shí)簡(jiǎn)介基礎(chǔ)知識(shí)簡(jiǎn)介理論塔板數(shù)(N): 分離效率的量度, 3HPLC 基礎(chǔ)知識(shí)簡(jiǎn)介基礎(chǔ)知識(shí)簡(jiǎn)介3 容量因子容量因子k3分離因子分離因子 3HPLC 基礎(chǔ)知識(shí)簡(jiǎn)介基礎(chǔ)知識(shí)簡(jiǎn)介理論塔板數(shù)(N): 分離效率的量度, 填料顆粒度越小填料顆粒度越小,N 越大；流動(dòng)相流速越大；流動(dòng)相流速V 越高越高,N 越大。柱長(zhǎng)越廠，越大。柱長(zhǎng)越廠，N越大。越大。3k， 和和N N，如何控制？，如何控制？ HPLC 系統(tǒng)系統(tǒng)組成部件組成部件 Waters HPLC 系統(tǒng)系統(tǒng)組成組成 硬件系統(tǒng)：泵(515,1515,1525,600,616,626)進(jìn)樣

4、器(7725i,717Plus)色譜柱(Symmetry C18, NovaPakC18,)檢測(cè)器(2698/2996, 2487,2475,EMD)2695/2795分離單元(溶劑管理與樣品管理集成為一體)軟件系統(tǒng)：軟件系統(tǒng)：積分儀(746)、工作站(PC800）數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)Breeze、Millennium32、EmpowerMasslynx4.0軟件平臺(tái)(LC-MS)Waters HPLC 系統(tǒng)系統(tǒng)1525-717-2487-Breeze系統(tǒng)1525-717-2998-Empower系統(tǒng)Waters 1525泵系統(tǒng)泵系統(tǒng)Waters 717自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣器48 or 96位樣品樣品盤(pán)

5、位樣品樣品盤(pán)可單獨(dú)操作也可外部控制可單獨(dú)操作也可外部控制(IEEE)Waters 2998 PDA檢測(cè)器檢測(cè)器PDA檢測(cè)器的三維檢測(cè)器的三維(3D)圖圖Waters HPLC 系統(tǒng)系統(tǒng)Alliance 系統(tǒng):-2690/5分離單元-2998檢測(cè)器-Empower2 控制軟件Waters的的HPLC系統(tǒng)系統(tǒng)Waters e2695系統(tǒng)系統(tǒng)-1.梯度比例閥(GPV);2.進(jìn)口閥;3.主柱塞（傳送溶液）;4.主壓力傳感器;5.蓄積柱塞（向系統(tǒng)輸送液體）;6.系統(tǒng)壓力傳感器;7.獨(dú)立的線性柱塞驅(qū)動(dòng)馬達(dá)（與傳統(tǒng)一個(gè)馬達(dá)驅(qū)動(dòng)串聯(lián)或并聯(lián)泵相比，無(wú)壓力波動(dòng)，沒(méi)有出口閥，減少故障率）流速精度達(dá)到0.075%Wa

6、ters e2695 進(jìn)樣系統(tǒng)系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)系統(tǒng)五個(gè)獨(dú)立的24位樣品盤(pán)Waters 2998 PDA檢測(cè)器檢測(cè)器PDA檢測(cè)器的三維檢測(cè)器的三維(3D)圖圖Waters液相操作液相操作1、溶劑準(zhǔn)備、溶劑準(zhǔn)備：色譜純級(jí)別色譜純級(jí)別a): 過(guò)濾過(guò)濾0.45m濾膜（濾膜（纖維素膜水溶液，纖維素膜水溶液， 尼龍、尼龍、PTFE通用型通用型）b):脫氣脫氣超聲超聲3-5min，排除，排除O2，N2等。等。保證流量準(zhǔn)確，提高色譜圖重現(xiàn)保證流量準(zhǔn)確，提高色譜圖重現(xiàn)性，增加信噪比（低紫外去氧氣吸收），保護(hù)色譜柱（填料氧化）。性，增加信噪比（低紫外去氧氣吸收），保護(hù)色譜柱（填料氧化）。c):溶劑截止波長(zhǎng)溶劑截止波長(zhǎng)

7、：最好避免，如乙腈和水：最好避免，如乙腈和水190nm, 甲醇和乙醇甲醇和乙醇210nm,等。等。d):緩沖鹽流動(dòng)相緩沖鹽流動(dòng)相：需現(xiàn)配現(xiàn)用，低溫密封保存最多：需現(xiàn)配現(xiàn)用，低溫密封保存最多3天；天； 有機(jī)溶劑和緩沖鹽（水）混配流動(dòng)相，需低溫保存。有機(jī)溶劑和緩沖鹽（水）混配流動(dòng)相，需低溫保存。e):溶劑混溶性溶劑混溶性：建議用色譜純：建議用色譜純10%異丙醇異丙醇o(jì)r水作為過(guò)渡溶劑。水作為過(guò)渡溶劑。Waters液相操作液相操作1、溶劑準(zhǔn)備、溶劑準(zhǔn)備： 1525系統(tǒng)系統(tǒng)：A,B兩通道流動(dòng)相，針頭清洗液（綠色）。兩通道流動(dòng)相，針頭清洗液（綠色）。 e2695系統(tǒng)系統(tǒng)： 流動(dòng)相流動(dòng)相-最多可以做最多可

8、以做A,B,C,D四通道梯度混合洗脫四通道梯度混合洗脫。灌注柱塞密封清洗液（灌注柱塞密封清洗液（seal wash）-一般建議使用一般建議使用10%20%甲醇甲醇水溶液。水溶液。針頭清洗液（綠色）針頭清洗液（綠色）- 一般選擇樣品最后幾分鐘洗脫相似的溶劑一般選擇樣品最后幾分鐘洗脫相似的溶劑作為洗脫溶劑。作為洗脫溶劑。 Waters液相操作液相操作2、開(kāi)機(jī)一般流程：、開(kāi)機(jī)一般流程：開(kāi)啟開(kāi)啟HPLC系統(tǒng)各個(gè)設(shè)備的電源。系統(tǒng)各個(gè)設(shè)備的電源。 1525系統(tǒng)系統(tǒng)：開(kāi)泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器開(kāi)泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器:待設(shè)備通過(guò)自檢后，打開(kāi)計(jì)待設(shè)備通過(guò)自檢后，打開(kāi)計(jì)算機(jī)。算機(jī)。打開(kāi)檢測(cè)器電源打開(kāi)檢測(cè)器電源:檢

9、測(cè)器通過(guò)自檢后（檢測(cè)器通過(guò)自檢后（3-5min）,才能被軟才能被軟件控制件控制, 建議有流動(dòng)相流經(jīng)檢測(cè)器后再開(kāi)啟電源建議有流動(dòng)相流經(jīng)檢測(cè)器后再開(kāi)啟電源。啟動(dòng)色譜管理軟件啟動(dòng)色譜管理軟件,1525系統(tǒng)沒(méi)有控制版面，所有操作都系統(tǒng)沒(méi)有控制版面，所有操作都需在軟件上執(zhí)行。需在軟件上執(zhí)行。 Waters液相操作液相操作 e2695系統(tǒng)系統(tǒng)：1）打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)）打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，儀器啟動(dòng)診斷程序會(huì)開(kāi)，儀器啟動(dòng)診斷程序會(huì)開(kāi)始始屏幕上會(huì)顯示Main界面，繼續(xù)進(jìn)行針頭、注射器和閥門(mén)，樣品轉(zhuǎn)盤(pán)托架和溶劑管理系統(tǒng)這些機(jī)械部件進(jìn)行診斷測(cè)試，測(cè)試成功后，系統(tǒng)進(jìn)入“Idle”狀態(tài)。常見(jiàn)問(wèn)題：“plunger homing o

10、ver pressure ”，初始化中斷。解決辦法：打開(kāi)排液閥，重新初始化。Waters液相操作液相操作 2）打開(kāi)在線脫氣機(jī)）打開(kāi)在線脫氣機(jī)：在面板中直接操作或者軟件中打開(kāi)。 Waters液相操作液相操作3）色譜泵排氣：）色譜泵排氣：3.1）dry prime: 干抽，儀器停放很長(zhǎng)干抽，儀器停放很長(zhǎng)時(shí)間后管路空了，無(wú)法時(shí)間后管路空了，無(wú)法wet prime時(shí)，時(shí)，用于快速排空氣泡。用于快速排空氣泡。Waters液相操作液相操作3.2） Wet prime: 濕抽濕抽， 快速替換管路中溶劑用的。注意：快速替換管路中溶劑用的。注意：溶劑的互溶性，溶劑的互溶性，如：如：在由緩沖溶劑改為高有機(jī)物含量的

11、溶劑在由緩沖溶劑改為高有機(jī)物含量的溶劑時(shí)，為避免時(shí)，為避免“分離單元分離單元”內(nèi)出現(xiàn)鹽沉淀，請(qǐng)使用中間溶劑內(nèi)出現(xiàn)鹽沉淀，請(qǐng)使用中間溶劑（如水）。（如水）。在在 Main （主）屏幕中，按（主）屏幕中，按 Menu/Status 顯示顯示 Status （狀態(tài)）屏幕。按（狀態(tài)）屏幕。按 Direct Functions 菜單。菜單。排氣后系統(tǒng)輸液溫度，壓力波動(dòng)小排氣后系統(tǒng)輸液溫度，壓力波動(dòng)小,一般在幾十一般在幾十Psi以?xún)?nèi)以?xún)?nèi)),否則否則,需重做排氣操作需重做排氣操作Waters液相操作液相操作4）清洗進(jìn)樣器系統(tǒng)：清洗進(jìn)樣器系統(tǒng)：當(dāng)更換流動(dòng)相或者發(fā)現(xiàn)注射器內(nèi)有氣泡當(dāng)更換流動(dòng)相或者發(fā)現(xiàn)注射器內(nèi)有氣

12、泡時(shí)（時(shí)（純甲醇清洗純甲醇清洗），需要對(duì)進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)），需要對(duì)進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)行清洗，主要包括對(duì)定量環(huán)和注射器的行清洗，主要包括對(duì)定量環(huán)和注射器的清洗清洗 。Waters液相操作液相操作2、系統(tǒng)平衡：跑基線系統(tǒng)平衡：跑基線 正確安裝色譜柱后，用準(zhǔn)備好的流動(dòng)相平衡系統(tǒng)，大約正確安裝色譜柱后，用準(zhǔn)備好的流動(dòng)相平衡系統(tǒng)，大約0.51h.3、樣品準(zhǔn)備樣品準(zhǔn)備：過(guò)濾，樣品瓶中應(yīng)有超過(guò)過(guò)濾，樣品瓶中應(yīng)有超過(guò)1/3高度高度 的樣品量。的樣品量。4、編制儀器方法，開(kāi)始試驗(yàn)，編制儀器方法，開(kāi)始試驗(yàn)，軟件操作。軟件操作。5、清洗清洗：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)對(duì)液相系統(tǒng)（進(jìn)樣器、泵、檢測(cè)器等）、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)對(duì)液相系統(tǒng)（進(jìn)樣器、泵、

13、檢測(cè)器等）、色譜柱進(jìn)行清洗色譜柱進(jìn)行清洗。建議批量進(jìn)樣后，最后進(jìn)一針建議批量進(jìn)樣后，最后進(jìn)一針50ul流動(dòng)相，如果流動(dòng)流動(dòng)相，如果流動(dòng)相中有鹽，則用純水代替緩沖鹽那部分比例相中有鹽，則用純水代替緩沖鹽那部分比例。清洗后色譜柱和系統(tǒng)中需。清洗后色譜柱和系統(tǒng)中需填充需要的溶劑。填充需要的溶劑。6、關(guān)機(jī)關(guān)機(jī)：退出：退出Empower控制軟件，依次關(guān)閉泵，檢測(cè)器，電腦等電控制軟件，依次關(guān)閉泵，檢測(cè)器，電腦等電源。源。Waters軟件操作軟件操作1、登入登入2、項(xiàng)目建立項(xiàng)目建立 3、方法編輯、方法編輯。Empower中所有功能都需要相應(yīng)的中所有功能都需要相應(yīng)的“方法方法”去實(shí)去實(shí)現(xiàn)?，F(xiàn)。 儀器方法儀器方

14、法：設(shè)置儀器參數(shù)采集樣品：設(shè)置儀器參數(shù)采集樣品 處理方法處理方法：對(duì)色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理計(jì)算：對(duì)色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理計(jì)算 報(bào)告方法報(bào)告方法：對(duì)色譜結(jié)果打印報(bào)告：對(duì)色譜結(jié)果打印報(bào)告 輸出方法輸出方法：輸出色譜數(shù)據(jù)。：輸出色譜數(shù)據(jù)。 方法組方法組：將上述方法組合，從而可以進(jìn)行數(shù)據(jù)的批處理。：將上述方法組合，從而可以進(jìn)行數(shù)據(jù)的批處理。4、單次進(jìn)樣和樣品組進(jìn)樣5、3D數(shù)據(jù)處理6、打印報(bào)告Waters軟件操作軟件操作常見(jiàn)儀器故障常見(jiàn)儀器故障-Troubleshooting1、流動(dòng)相及溶劑瓶流動(dòng)相及溶劑瓶 流動(dòng)相脫氣不充分易引起噪聲大，出現(xiàn)毛刺峰。溶劑過(guò)濾器流動(dòng)相脫氣不充分易引起噪聲大，出現(xiàn)毛刺峰。溶劑過(guò)濾器堵塞

15、會(huì)引起流動(dòng)相供給不暢，壓力不穩(wěn)。流動(dòng)相被污染了會(huì)引堵塞會(huì)引起流動(dòng)相供給不暢，壓力不穩(wěn)。流動(dòng)相被污染了會(huì)引起基線上升，梯度洗脫出現(xiàn)鬼峰。起基線上升，梯度洗脫出現(xiàn)鬼峰。2、初始化錯(cuò)誤初始化錯(cuò)誤：Plunger homing over pressure-在線過(guò)在線過(guò)濾器堵塞。濾器堵塞。3、泵常見(jiàn)故障、泵常見(jiàn)故障：Lost Prime-單向閥堵死。單向閥堵死。4、進(jìn)樣器故障進(jìn)樣器故障：需使用匹配的進(jìn)樣瓶，易出現(xiàn)進(jìn)樣針堵塞，：需使用匹配的進(jìn)樣瓶，易出現(xiàn)進(jìn)樣針堵塞，空白溶劑出現(xiàn)色譜峰時(shí)，需加倍清洗或者調(diào)整樣品濃度順序空白溶劑出現(xiàn)色譜峰時(shí)，需加倍清洗或者調(diào)整樣品濃度順序（L-H）。）。 常見(jiàn)儀器故障常見(jiàn)儀器

16、故障-Troubleshooting5、色譜柱故障：、色譜柱故障：6、檢測(cè)器故障、檢測(cè)器故障：燈故障易引起噪聲大，靈敏度下降。燈故障易引起噪聲大，靈敏度下降。流動(dòng)相和樣品臟易引起流通池污染和堵塞故障流動(dòng)相和樣品臟易引起流通池污染和堵塞故障。常見(jiàn)儀器故障常見(jiàn)儀器故障-Troubleshooting7、堵堵-壓力高壓力高柱壓升高，升高的依據(jù)應(yīng)該跟之前相同條件下所得的柱壓進(jìn)行柱壓升高，升高的依據(jù)應(yīng)該跟之前相同條件下所得的柱壓進(jìn)行對(duì)比。對(duì)比。堵應(yīng)該先排除是系統(tǒng)堵還是柱子堵，首先斷開(kāi)色譜柱，連接兩堵應(yīng)該先排除是系統(tǒng)堵還是柱子堵，首先斷開(kāi)色譜柱，連接兩通，如果壓力超過(guò)通，如果壓力超過(guò)1500psi，那么系

17、統(tǒng)肯定是堵了，滯后逐一，那么系統(tǒng)肯定是堵了，滯后逐一排查，清洗或者更換被堵部件。排查，清洗或者更換被堵部件。Notes:溶劑吸濾頭溶劑吸濾頭,進(jìn)出口閥及管路進(jìn)出口閥及管路(包括進(jìn)樣器和檢測(cè)池包括進(jìn)樣器和檢測(cè)池)若被污染若被污染,應(yīng)作清應(yīng)作清洗和鈍化處理。一般采用洗和鈍化處理。一般采用30磷酸水溶液作為清洗劑，用磷酸水溶液作為清洗劑，用6M硝酸作為鈍硝酸作為鈍化劑，先清洗再鈍化化劑，先清洗再鈍化。清洗的目的是去除不銹鋼管路及系統(tǒng)內(nèi)的污垢。鈍。清洗的目的是去除不銹鋼管路及系統(tǒng)內(nèi)的污垢。鈍化的目的是使不銹鋼管路的內(nèi)表面形成光滑均勻的氧化膜。化的目的是使不銹鋼管路的內(nèi)表面形成光滑均勻的氧化膜。（清洗鈍

18、化步驟：設(shè)（清洗鈍化步驟：設(shè)ABCD25% 1ml/min 水水-30%磷酸磷酸or6M硝酸硝酸 45min-水至中性水至中性-甲醇）甲醇）常見(jiàn)儀器故障常見(jiàn)儀器故障-Troubleshooting 色譜柱堵塞引起壓力高色譜柱堵塞引起壓力高，可能由于填料表面物質(zhì)吸附，可能由于填料表面物質(zhì)吸附或沉淀引起，則需對(duì)色譜柱進(jìn)行清洗，建議方法低流速或沉淀引起，則需對(duì)色譜柱進(jìn)行清洗，建議方法低流速清洗。清洗。反相色譜柱：水，甲醇，四氫呋喃，二氯甲烷反相色譜柱：水，甲醇，四氫呋喃，二氯甲烷, 甲醇甲醇 和水和水正相色譜柱：二氯甲烷，四氫呋喃正相色譜柱：二氯甲烷，四氫呋喃THF, 水水,甲醇，甲醇， 二氯甲烷。二氯甲烷。如果還是不行，則可考慮反沖或者購(gòu)買(mǎi)新柱如果還是不行，則可考慮反沖或者購(gòu)買(mǎi)新柱。常見(jiàn)色譜圖故障常見(jiàn)色譜圖故障-Troubleshooting1、色譜圖保留時(shí)間變化問(wèn)題、色譜圖保留時(shí)間變化問(wèn)題A）前后兩針進(jìn)