血紅蛋白的提取和分離 學案

1、§5.3血紅蛋白的提取和分離導學案 班級：高二（ ）班 姓名： 【學習目標】1.概述凝膠色譜法、電泳法分離大分子的基本原理。2.知道緩沖溶液的作用。3.嘗試對血液中血紅蛋白進行提取和分離,體驗從復雜體系中提取生物大分子的基礎過程和方法。4.掌握對樣品的預處理、色譜柱制作及裝填等操作,進行樣品的加入和洗脫并最終分離出血紅蛋白?！咀灾鲗W習】一、基礎知識1.蛋白質的分離依據(jù):蛋白質特性的差異,如分子的形狀和_、所帶_的性質和多少、溶解度、_和對其他分子的親和力等。2.凝膠色譜法:(1)概念:也稱做_,是根據(jù)_分離蛋白質的有效方法。(2)凝膠的特點形態(tài):微小的_組成:大多數(shù)由_構成結構:內部

2、有許多_(3)常用凝膠:_和瓊脂糖。(4)分離原理。相對分子質量較小的蛋白質容易進入凝膠內部的通道,路程_,移動速度_,通過凝膠的時間_。相對分子質量較大的蛋白質無法進入凝膠內部的通道,只能在凝膠_移動,路程_,移動速度_,通過凝膠的時間_。 3.緩沖溶液:(1)作用:在一定范圍內,緩沖溶液能夠抵制_對溶液pH的影響,維持pH基本不變。(2)配制:通常由12種緩沖劑溶解于水中配制而成。調節(jié)緩沖劑的_就可以制得_的緩沖液。(3)意義:為了能夠在實驗室條件下準確模擬生物體內的過程,保持_與體內環(huán)境中的pH基本一致。4.電泳:(1)概念:帶電粒子在_的作用下發(fā)生_的過程。(2)原理。帶電粒子:許多重

3、要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有_的基團,在一定的pH下,這些基團會帶上_。遷移動力與方向:在電場的作用下,帶電分子會向著與其_的電極移動。分離依據(jù):電泳利用了待分離樣品中各種分子_以及分子本身的_、_的不同,使帶電分子產生_,從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。(3)常用的電泳方法:_電泳和_電泳。 二、實驗操作1.樣品處理:(1)紅細胞的洗滌。目的:去除_。方法:_。標準:直至上清液不再呈現(xiàn)_。(2)血紅蛋白的釋放。 (3)分離血紅蛋白溶液。方法:混合液 分層。分層結果(自上而下):第1層:無色透明的_。第2層:脂溶性物質的_白色薄層固體。 第3層:_的水溶液_透明液體。第4層:其他雜質的暗

4、紅色沉淀物。結果處理:將試管中的液體用_過濾,除去_沉淀層,于分液漏斗中靜置片刻后,分出下層的_液體。2.透析粗分離:(1)過程:取1 mL的_溶液裝入_中,將其放入盛有300 mL的物質的量濃度為20 mmol/L的_中(pH為7.0),透析_ h。(2)原理:透析袋能使_自由進出,而將_保留在袋內。(3)目的:去除樣品中_的雜質。3.凝膠色譜操作純化:(1)凝膠色譜柱的制作(2)凝膠色譜柱的裝填:凝膠用_充分溶脹后,配成凝膠懸浮液,_緩慢倒入凝膠色譜柱內(3)樣品的加入 加樣前：打開流出口，使柱內凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面_，關閉出口加樣：用吸管小心地將1 mL透析后的樣品加到色譜

5、柱的_，注意不要破壞凝膠面加樣后：打開下端出口，使樣品滲入_內(4)洗脫:_下端出口,加入磷酸緩沖液,連接_,_下端出口,進行洗脫4.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳純度鑒定:判斷純化的蛋白質是否達到要求,需要進行_的鑒定。鑒定方法中,使用最多的是_。三、操作提示1.紅細胞的洗滌:_、離心速度與_十分重要。洗滌次數(shù)過少,無法除去_蛋白;離心速度過高和時間過長會使白細胞等一同沉淀,達不到分離的效果。2.色譜柱填料的處理:商品凝膠使用前需直接放在_中膨脹,可以將加入洗脫液的濕凝膠用沸水浴加熱,加速膨脹。3.凝膠色譜柱的裝填:在裝填凝膠柱時,不得有氣泡存在。氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的_,降低_。4.蛋白質

6、的分離:如果紅色區(qū)帶_,說明色譜柱制作成功?！绢A習小測】1.相對分子質量較大的蛋白質,無法進入凝膠內部的通道,移動速度較慢。( )2.凝膠色譜法分離蛋白質時利用了蛋白質相對分子質量大小和形狀的不同。( )3.電泳法分離樣品只取決于蛋白質的相對分子質量大小。( )4.紅細胞的洗滌是為了徹底除去雜蛋白,應快速高速離心。( )5.豬成熟紅細胞中缺少細胞器和細胞核,提純時雜蛋白較少。( )6.樣品處理和粗分離的目的都是除去相對分子質量較小的雜質。( )7.若紅色區(qū)帶均勻一致地移動,說明色譜柱制作成功。( )8.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質的依據(jù)是蛋白質分子相對分子質量和帶電性質的差異。( )【

7、合作探究】主題1蛋白質的分離原理及方法1.凝膠色譜法： 結合上圖，說出凝膠色譜法分離不同物質的依據(jù)并填表比較蛋白質的運動情況。(1)依據(jù)：_。(2)蛋白質在凝膠中的運動情況：相對分子質量區(qū)別相對分子質量大相對分子質量小運動方式垂直向_運動無規(guī)則的_運動運動速度_較慢運動路程_洗脫次序_從凝膠柱中洗脫出來_從凝膠柱中洗脫出來2.電泳：(1)從電荷方面分析適合電泳法分離的各種分子應具備的條件是：各種分子應帶有不同_和不同量的_。(2)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質是否依據(jù)蛋白質所帶電荷的差異？為什么？提示：_。因為SDS能與蛋白質結合，它所帶負電荷的量遠大于蛋白質分子原有的_，因而掩蓋了不同

8、蛋白質間的_，使電泳遷移率完全由蛋白質分子的_決定。主題2血紅蛋白的提取與分離實驗操作1.實驗操作：(1)哺乳動物成熟的紅細胞適用于進行蛋白質的分離的原因有哪些？提示：哺乳動物成熟紅細胞內沒有_和各種復雜的_，排除了其他物質對實驗結果的干擾。血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該收集洗脫液。(2)請分析洗滌紅細胞的目的，總結判斷紅細胞洗滌干凈的依據(jù)。目的：_。依據(jù)：_。(3)探究血紅蛋白釋放過程中蒸餾水和甲苯的作用。蒸餾水的作用：使紅細胞_，釋放細胞內_；甲苯的作用溶解_，有助于血紅蛋白的釋放。(4)寫出分離血紅蛋白混合液的結果。混合液分為4層 第1層(最上

9、層)：_第2層(中上層)：_第3層(中下層)：_第4層(最下層)：_(5)將收集的血紅蛋白溶液放在透析袋中進行透析，透析的目的是什么？提示：血紅蛋白是大分子物質，不能透過透析袋，這樣可以去除_的雜質。2.凝膠色譜操作：(1)在制作凝膠色譜柱時，若凝膠色譜柱的高度不足，則_。(2)試從凝膠色譜的分離原理分析凝膠若裝填得不夠緊密、均勻，則會：在色譜柱內形成無效的空隙，使本該進入凝膠內部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂_，影響分離的效果。(3)氣泡對蛋白質分離產生的影響是_。(4)推測樣品洗脫時，紅色區(qū)帶可能會出現(xiàn)哪些情況？提示：如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶_；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬