流式細(xì)胞凋亡分析PPT學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1流式細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞凋亡(dio wn)分析分析第一頁，共105頁。概概 念念 細(xì)胞凋亡是維持人體正常細(xì)胞凋亡是維持人體正常(zhngchng)(zhngchng)生生理過程和功能活動所必需的，是多細(xì)胞生物生命理過程和功能活動所必需的，是多細(xì)胞生物生命活動過程中不可缺少的組成內(nèi)容，是其藉以存活活動過程中不可缺少的組成內(nèi)容，是其藉以存活的需要，貫穿了生物全部生命周期中。的需要，貫穿了生物全部生命周期中。第1頁/共105頁第二頁，共105頁。概概 念念 細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死（細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死（necrosisnecrosis）是細(xì)胞）是細(xì)胞死亡的兩種模式，但兩者有明顯的區(qū)別。后者死亡的兩種

2、模式，但兩者有明顯的區(qū)別。后者是由于細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷或或大劑量細(xì)胞毒藥是由于細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷或或大劑量細(xì)胞毒藥物作用后發(fā)生物作用后發(fā)生(fshng)(fshng)的被動分解過程，的被動分解過程，并可導(dǎo)致周圍組織的炎癥反應(yīng)。并可導(dǎo)致周圍組織的炎癥反應(yīng)。第2頁/共105頁第三頁，共105頁。概概 念念細(xì)胞凋亡的作用主要包括以下幾方面：細(xì)胞凋亡的作用主要包括以下幾方面：清除無功能的細(xì)胞；清除無功能的細(xì)胞；控制控制(kngzh)(kngzh)細(xì)胞數(shù)量；細(xì)胞數(shù)量；清除病態(tài)的或有害的細(xì)胞；清除病態(tài)的或有害的細(xì)胞；清除多余的細(xì)胞；清除多余的細(xì)胞；第3頁/共105頁第四頁，共105頁。細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡(dio

3、 wn)的特征的特征形態(tài)學(xué)特征：形態(tài)學(xué)特征： 光鏡下，凋亡細(xì)胞最突出的形態(tài)學(xué)特征是光鏡下，凋亡細(xì)胞最突出的形態(tài)學(xué)特征是細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)濃集、細(xì)胞變圓皺縮而細(xì)細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)濃集、細(xì)胞變圓皺縮而細(xì)胞膜保持胞膜保持(boch)(boch)完整，其中胞核變化尤為完整，其中胞核變化尤為突出。染色質(zhì)的濃集可能是由于凋亡細(xì)胞核雙突出。染色質(zhì)的濃集可能是由于凋亡細(xì)胞核雙鏈鏈DNADNA發(fā)生裂解所致。發(fā)生裂解所致。第4頁/共105頁第五頁，共105頁。細(xì)胞細(xì)胞(xbo)凋亡的特征凋亡的特征形態(tài)學(xué)特征：形態(tài)學(xué)特征： DNA DNA降解后，形成長度主要為降解后，形成長度主要為180-200bp180-200b

4、p的的DNADNA片斷，隨后細(xì)胞裂解成許多有膜包被的片斷，隨后細(xì)胞裂解成許多有膜包被的小體，稱為凋亡小體（小體，稱為凋亡小體（apoptotic bodies),apoptotic bodies),最后被巨噬細(xì)胞吞噬，但不會引起周圍組織最后被巨噬細(xì)胞吞噬，但不會引起周圍組織(zzh)(zzh)的炎癥反應(yīng)。凋亡小體是凋亡細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。凋亡小體是凋亡細(xì)胞特征性的標(biāo)志。如在顯微鏡下觀察到凋亡小特征性的標(biāo)志。如在顯微鏡下觀察到凋亡小體，則可確認(rèn)為細(xì)胞發(fā)生了凋亡。體，則可確認(rèn)為細(xì)胞發(fā)生了凋亡。第5頁/共105頁第六頁，共105頁。細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡(dio wn)的特征的特征形態(tài)學(xué)特征：形態(tài)學(xué)特征： 電

5、鏡下，細(xì)胞核內(nèi)可見高電子密度區(qū)電鏡下，細(xì)胞核內(nèi)可見高電子密度區(qū)，這是核，這是核DNADNA在核小體連接處斷裂成核小體在核小體連接處斷裂成核小體后，在異染色質(zhì)區(qū)聚集形成的染色質(zhì)濃縮后，在異染色質(zhì)區(qū)聚集形成的染色質(zhì)濃縮塊。染色質(zhì)聚集區(qū)以外的低電子密度區(qū)為塊。染色質(zhì)聚集區(qū)以外的低電子密度區(qū)為透明區(qū)，是由于核孔變大導(dǎo)致其通透性增透明區(qū)，是由于核孔變大導(dǎo)致其通透性增加，細(xì)胞質(zhì)中水分不斷滲入而造成。線粒加，細(xì)胞質(zhì)中水分不斷滲入而造成。線粒體增殖，呈空泡化。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔擴(kuò)大，為凋體增殖，呈空泡化。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔擴(kuò)大，為凋亡細(xì)胞形成自噬體提供包裹膜。細(xì)胞骨架亡細(xì)胞形成自噬體提供包裹膜。細(xì)胞骨架變得致密變得致密(zhm)

6、(zhm)、紊亂。、紊亂。第6頁/共105頁第七頁，共105頁。細(xì)胞細(xì)胞(xbo)凋亡的特征凋亡的特征形態(tài)學(xué)特征形態(tài)學(xué)特征(tzhng)(tzhng)： 第7頁/共105頁第八頁，共105頁。細(xì)胞細(xì)胞(xbo)凋亡的特征凋亡的特征形態(tài)學(xué)特征形態(tài)學(xué)特征(tzhng)(tzhng)： 第8頁/共105頁第九頁，共105頁。細(xì)胞細(xì)胞(xbo)凋亡的特征凋亡的特征形態(tài)學(xué)特征：形態(tài)學(xué)特征： 共聚焦顯微鏡觀察，凋亡細(xì)胞膜電位和線粒共聚焦顯微鏡觀察，凋亡細(xì)胞膜電位和線粒體膜電位下降，膜流動性降低。細(xì)胞膜上新出現(xiàn)體膜電位下降，膜流動性降低。細(xì)胞膜上新出現(xiàn)了一些生物大分子如磷脂酰絲氨酸（了一些生物大分子如磷脂酰

7、絲氨酸（phosphatidylserine,ps)phosphatidylserine,ps)和凝血酶敏感蛋白等，和凝血酶敏感蛋白等，這些分子的出現(xiàn)與凋亡細(xì)胞的清除這些分子的出現(xiàn)與凋亡細(xì)胞的清除(qngch)(qngch)有有關(guān)。關(guān)。 第9頁/共105頁第十頁，共105頁。細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡(dio wn)的特征的特征形態(tài)學(xué)特征：形態(tài)學(xué)特征： 凋亡細(xì)胞另一個形態(tài)特征通過總凋亡細(xì)胞另一個形態(tài)特征通過總DNADNA提取，提取，DNADNA凝膠電泳分析，可呈現(xiàn)出梯狀圖譜，可見凝膠電泳分析，可呈現(xiàn)出梯狀圖譜，可見(kjin)(kjin)清晰的清晰的DNADNA梯子梯子(ladder)(ladder)。

8、 第10頁/共105頁第十一頁，共105頁。細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡(dio wn)的特征的特征生化特征：生化特征：1 caspase1 caspase蛋白酶：蛋白酶： 細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展過程也可能是水解酶細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展過程也可能是水解酶級聯(lián)切割的過程，它將大分子級聯(lián)切割的過程，它將大分子(fnz)(fnz)結(jié)構(gòu)的物結(jié)構(gòu)的物質(zhì)如質(zhì)如DNADNA、細(xì)胞骨架水解變性成小分子、細(xì)胞骨架水解變性成小分子(fnz)(fnz)碎片，致使細(xì)胞發(fā)生凋亡。碎片，致使細(xì)胞發(fā)生凋亡。第11頁/共105頁第十二頁，共105頁。細(xì)胞細(xì)胞(xbo)凋亡的特征凋亡的特征生化特征：生化特征：1 caspase1 caspas

9、e蛋白酶：蛋白酶： 其中，半胱氨酸蛋白酶家族發(fā)揮了重要其中，半胱氨酸蛋白酶家族發(fā)揮了重要作用。它具有一段攜帶活化位點(diǎn)的保守氨基作用。它具有一段攜帶活化位點(diǎn)的保守氨基酸序列，可以特異性識別、切割天冬氨酸轉(zhuǎn)酸序列，可以特異性識別、切割天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶殘基。由于這些蛋白酶具有相同氨甲酰酶殘基。由于這些蛋白酶具有相同(xin(xin tn tn) )的結(jié)構(gòu)和功能特性而被稱為的結(jié)構(gòu)和功能特性而被稱為caspasecaspase。第12頁/共105頁第十三頁，共105頁。細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡(dio wn)的特征的特征生化特征：生化特征：1 caspase1 caspase蛋白酶：蛋白酶： caspase

10、caspase可能可能(knng)(knng)在凋亡細(xì)胞的在凋亡細(xì)胞的形態(tài)變化中起了主導(dǎo)作用。形態(tài)變化中起了主導(dǎo)作用。CaspaseCaspase通常是通常是以酶原形式存在，通過其自身誘發(fā)的蛋白以酶原形式存在，通過其自身誘發(fā)的蛋白水解而轉(zhuǎn)化為有活性的酶，活化的水解而轉(zhuǎn)化為有活性的酶，活化的caspasecaspase進(jìn)一步激活其他的進(jìn)一步激活其他的caspasecaspase前體，形成了級前體，形成了級聯(lián)放大切割過程，裂解重要的大分子物質(zhì)聯(lián)放大切割過程，裂解重要的大分子物質(zhì)，導(dǎo)致凋亡。，導(dǎo)致凋亡。第13頁/共105頁第十四頁，共105頁。細(xì)胞細(xì)胞(xbo)凋亡的特征凋亡的特征生化特征：生化特征

11、：1 caspase1 caspase蛋白酶：蛋白酶： 目前已發(fā)現(xiàn)目前已發(fā)現(xiàn)1515個個caspasecaspase家族成員家族成員(chngyun)(chngyun)，分別命名為，分別命名為caspase-1caspase-11515，并，并根據(jù)其功能特點(diǎn)分成兩類，即啟動根據(jù)其功能特點(diǎn)分成兩類，即啟動caspase(caspase-2caspase(caspase-2、8 8、9 9、1010）和效應(yīng)）和效應(yīng)caspase(caspase3caspase(caspase3、6 6、7 7）。）。第14頁/共105頁第十五頁，共105頁。細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡(dio wn)的特征的特征生化特征：生

12、化特征：1 caspase1 caspase蛋白酶：蛋白酶： 啟動啟動caspasecaspase作用于凋亡信號觸發(fā)后上游的作用于凋亡信號觸發(fā)后上游的不可逆位點(diǎn)。效應(yīng)不可逆位點(diǎn)。效應(yīng)caspasecaspase由啟動胱冬肽酶激活由啟動胱冬肽酶激活，作用于下游的執(zhí)行位點(diǎn)，裂解細(xì)胞成凋亡小，作用于下游的執(zhí)行位點(diǎn)，裂解細(xì)胞成凋亡小體。分子結(jié)構(gòu)相互聯(lián)系的這兩部分影響線粒體體。分子結(jié)構(gòu)相互聯(lián)系的這兩部分影響線粒體，通過線粒體方式執(zhí)行凋亡的信號。，通過線粒體方式執(zhí)行凋亡的信號。bcl-2bcl-2家族家族成員成員(chngyun)(chngyun)能調(diào)節(jié)執(zhí)行位點(diǎn)的進(jìn)程。能調(diào)節(jié)執(zhí)行位點(diǎn)的進(jìn)程。第15頁/共1

13、05頁第十六頁，共105頁。細(xì)胞細(xì)胞(xbo)凋亡的特征凋亡的特征生化特征：生化特征：1 caspase1 caspase蛋白酶：蛋白酶： caspase-3 caspase-3是最重要的指示蛋白酶，為是最重要的指示蛋白酶，為17kD17kD和和12kD12kD亞單位組成的異二聚體。活化的亞單位組成的異二聚體。活化的caspase-3caspase-3可可以蛋白水解切割和激活其他以蛋白水解切割和激活其他caspasecaspase、相關(guān)的胞質(zhì)、相關(guān)的胞質(zhì)靶位點(diǎn)（細(xì)胞因子靶位點(diǎn)（細(xì)胞因子1818，CK18)CK18)和細(xì)胞核靶位點(diǎn)。和細(xì)胞核靶位點(diǎn)。Caspase-3Caspase-3切割切割CK

14、18CK18是凋亡是凋亡(dio wn(dio wn) )過程中過程中caspasecaspase切割發(fā)生的早期指示因子。切割發(fā)生的早期指示因子。 第16頁/共105頁第十七頁，共105頁。細(xì)胞細(xì)胞(xbo)凋亡的特征凋亡的特征生化特征：生化特征：2 2 核酸內(nèi)切酶的激活：核酸內(nèi)切酶的激活： 細(xì)胞凋亡時，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，細(xì)胞凋亡時，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，將核小體間連接將核小體間連接DNADNA降解，形成長度主要為降解，形成長度主要為180-180-200bp200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段，組蛋白和其他核整數(shù)倍的寡核苷酸片段，組蛋白和其他核內(nèi)蛋白質(zhì)不降解，核基質(zhì)也不改變。在內(nèi)蛋白質(zhì)不降

15、解，核基質(zhì)也不改變。在DNADNA凝膠凝膠電泳分析中呈現(xiàn)出特征性電泳分析中呈現(xiàn)出特征性“梯狀梯狀”條帶，而細(xì)條帶，而細(xì)胞壞死時，胞壞死時，DNADNA片斷大小不一，無片斷大小不一，無“梯狀梯狀”條帶條帶出現(xiàn)出現(xiàn)(chxin)(chxin)。但并非所有凋亡細(xì)胞都能檢。但并非所有凋亡細(xì)胞都能檢測到這種典型的生化特征。測到這種典型的生化特征。 第17頁/共105頁第十八頁，共105頁。細(xì)胞細(xì)胞(xbo)凋亡的特征凋亡的特征生化特征：生化特征：2 2 核酸核酸(h sun)(h sun)內(nèi)切酶的激活：內(nèi)切酶的激活： 第18頁/共105頁第十九頁，共105頁。細(xì)胞細(xì)胞(xbo)凋亡的特征凋亡的特征生化特

16、征：生化特征：3 3 線粒體的變化：線粒體的變化： 線粒體發(fā)生的重要改變之一就是凋亡誘導(dǎo)線粒體發(fā)生的重要改變之一就是凋亡誘導(dǎo)因子使線粒體通透性升高，膜上巨型因子使線粒體通透性升高，膜上巨型(j (j xnxn) )通道開放，使線粒體蛋白進(jìn)入細(xì)胞液中通道開放，使線粒體蛋白進(jìn)入細(xì)胞液中，線粒體膜兩側(cè)質(zhì)子不對稱性消失，線粒體膜，線粒體膜兩側(cè)質(zhì)子不對稱性消失，線粒體膜電位迅速下降，電子傳遞與呼吸鏈解偶聯(lián)。電位迅速下降，電子傳遞與呼吸鏈解偶聯(lián)。 第19頁/共105頁第二十頁，共105頁。細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡(dio wn)的特征的特征生化特征：生化特征：3 3 線粒體的變化：線粒體的變化： 線粒體膜電位的變

17、化發(fā)生在細(xì)胞凋亡的早線粒體膜電位的變化發(fā)生在細(xì)胞凋亡的早期。線粒體膜電位是由于其內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子和其期。線粒體膜電位是由于其內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子和其他離子分布不對稱造成的。線粒體參與了凋亡他離子分布不對稱造成的。線粒體參與了凋亡的調(diào)控和實(shí)施。與凋亡密切相關(guān)的的調(diào)控和實(shí)施。與凋亡密切相關(guān)的bcl-2bcl-2家族家族(jiz)(jiz)分布在細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)，其中線粒體外分布在細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)，其中線粒體外膜上分布最多，膜上分布最多，bcl-2bcl-2具有抑制線粒體通透性變具有抑制線粒體通透性變化的能力，并通過此途徑抑制細(xì)胞凋亡?；哪芰?，并通過此途徑抑制細(xì)胞凋亡。 第20頁/共105頁第二十一頁，共105頁。細(xì)

18、胞細(xì)胞(xbo)凋亡的特征凋亡的特征生化特征：生化特征：4 4 胞質(zhì)胞質(zhì)Ca2+Ca2+和和pHpH的變化：的變化： 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)Ca2+Ca2+和和H+H+濃度的穩(wěn)定對維持生命活動濃度的穩(wěn)定對維持生命活動至關(guān)重要。胞內(nèi)至關(guān)重要。胞內(nèi)Ca2+Ca2+庫的釋放，胞質(zhì)庫的釋放，胞質(zhì)Ca2+Ca2+與細(xì)胞與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。胞外凋亡關(guān)系密切。胞外Ca2+Ca2+內(nèi)流促使胞質(zhì)內(nèi)流促使胞質(zhì)Ca2+Ca2+持續(xù)持續(xù)(chx)(chx)升高，作為凋亡信號啟動凋亡發(fā)生。升高，作為凋亡信號啟動凋亡發(fā)生。 第21頁/共105頁第二十二頁，共105頁。細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡(dio wn)的特征的特征生化特征：生化特征：

19、4 4 胞質(zhì)胞質(zhì)Ca2+Ca2+和和pHpH的變化：的變化： 此外，此外，Ca2+Ca2+的釋放打破了細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的的釋放打破了細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，使得細(xì)胞凋亡效應(yīng)穩(wěn)定，使得細(xì)胞凋亡效應(yīng)(xioyng)(xioyng)系統(tǒng)系統(tǒng)的關(guān)鍵成分開始和細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常時不能接觸的關(guān)鍵成分開始和細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常時不能接觸到的基質(zhì)接觸，從而觸發(fā)細(xì)胞凋亡。到的基質(zhì)接觸，從而觸發(fā)細(xì)胞凋亡。 第22頁/共105頁第二十三頁，共105頁。細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡(dio wn)的特征的特征生化特征：生化特征：4 4 胞質(zhì)胞質(zhì)Ca2+Ca2+和和pHpH的變化：的變化： 細(xì)胞細(xì)胞pHpH的變化可影響細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡時的變化可影響細(xì)胞凋

20、亡。細(xì)胞凋亡時伴隨胞質(zhì)伴隨胞質(zhì)pHpH降低，胞質(zhì)酸化影響細(xì)胞凋亡。胞質(zhì)降低，胞質(zhì)酸化影響細(xì)胞凋亡。胞質(zhì)pHpH降低可能與胞質(zhì)降低可能與胞質(zhì)Ca2+Ca2+升高有關(guān)升高有關(guān)(yugun)(yugun)。胞。胞質(zhì)酸化主要通過激活酸性質(zhì)酸化主要通過激活酸性DNaseDNase啟動細(xì)胞凋亡。啟動細(xì)胞凋亡。pHpH降低也影響了一些酸性功能蛋白在細(xì)胞凋亡過降低也影響了一些酸性功能蛋白在細(xì)胞凋亡過程中的作用。程中的作用。 第23頁/共105頁第二十四頁，共105頁。細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡(dio wn)的基因的基因調(diào)控調(diào)控 細(xì)胞凋亡受基因細(xì)胞凋亡受基因(jyn)(jyn)的調(diào)控，其的調(diào)控，其機(jī)制非常復(fù)雜。凋亡基因

21、機(jī)制非常復(fù)雜。凋亡基因(jyn)(jyn)可分為可分為兩類：兩類：1 1誘導(dǎo)基因誘導(dǎo)基因(jyn)(jyn)：野生型：野生型p53p53基因基因(jyn)(jyn)、c-mycc-myc、細(xì)胞表面抗原基因、細(xì)胞表面抗原基因(jyn)Apo-1(Fas)(jyn)Apo-1(Fas)等等2 2抑制基因抑制基因(jyn)(jyn)：bcl-2bcl-2、突變型、突變型p53p53基因基因(jyn)(jyn)和和rasras基因基因(jyn)(jyn)等等 第24頁/共105頁第二十五頁，共105頁。細(xì)胞細(xì)胞(xbo)凋亡的基因調(diào)控凋亡的基因調(diào)控 上述兩類基因蛋白產(chǎn)物的表達(dá)對凋亡上述兩類基因蛋白產(chǎn)物

22、的表達(dá)對凋亡(dio wn(dio wn) )起重要調(diào)控作用。誘導(dǎo)基因蛋起重要調(diào)控作用。誘導(dǎo)基因蛋白產(chǎn)物表達(dá)上調(diào)，可提高細(xì)胞對凋亡白產(chǎn)物表達(dá)上調(diào)，可提高細(xì)胞對凋亡(dio (dio wnwn) )信號的敏感性，促進(jìn)凋亡信號的敏感性，促進(jìn)凋亡(dio (dio wnwn) )發(fā)生。抑制基因蛋白產(chǎn)物表達(dá)，可降發(fā)生。抑制基因蛋白產(chǎn)物表達(dá)，可降低細(xì)胞對凋亡低細(xì)胞對凋亡(dio wn(dio wn) )信號的敏感性，信號的敏感性，抑制或推遲凋亡抑制或推遲凋亡(dio wn(dio wn) )。第25頁/共105頁第二十六頁，共105頁。細(xì)胞凋亡的基因細(xì)胞凋亡的基因(jyn)調(diào)控調(diào)控 誘導(dǎo)與抑制凋亡兩大基

23、因蛋白表達(dá)的平衡，誘導(dǎo)與抑制凋亡兩大基因蛋白表達(dá)的平衡，可對細(xì)胞的增殖、分化可對細(xì)胞的增殖、分化(fnhu)(fnhu)和死亡進(jìn)行調(diào)和死亡進(jìn)行調(diào)控，維持細(xì)胞群體的正常穩(wěn)定性。當(dāng)調(diào)控失衡時控，維持細(xì)胞群體的正常穩(wěn)定性。當(dāng)調(diào)控失衡時，就會導(dǎo)致疾病，如腫瘤、，就會導(dǎo)致疾病，如腫瘤、AIDSAIDS、霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤等。等。第26頁/共105頁第二十七頁，共105頁。細(xì)胞凋亡的基因細(xì)胞凋亡的基因(jyn)調(diào)控調(diào)控常見的凋亡基因及其蛋白：常見的凋亡基因及其蛋白：1 bcl-2 1 bcl-2 是研究是研究(ynji)(ynji)最早的與凋亡有關(guān)的最早的與凋亡有關(guān)的基因。基因。 bcl-2 bc

24、l-2基因是一種對細(xì)胞凋亡具有明顯基因是一種對細(xì)胞凋亡具有明顯抑制作用的癌基因。它是阻止細(xì)胞死亡的最后途抑制作用的癌基因。它是阻止細(xì)胞死亡的最后途徑，而對細(xì)胞周期無明顯影響。它能抑制由許多徑，而對細(xì)胞周期無明顯影響。它能抑制由許多因子，如化療藥物、某些病毒、因子，如化療藥物、某些病毒、p53p53、c-mycc-myc及生及生長因子等激發(fā)的凋亡。長因子等激發(fā)的凋亡。第27頁/共105頁第二十八頁，共105頁。細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡(dio wn)的基因的基因調(diào)控調(diào)控常見常見(chn(chn jin) jin)的凋亡基因及其蛋白：的凋亡基因及其蛋白：2 p53 p532 p53 p53基因不僅是一種與

25、腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)基因不僅是一種與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的抑癌基因，而且參與細(xì)胞生長、分化及死亡的的抑癌基因，而且參與細(xì)胞生長、分化及死亡的調(diào)控。調(diào)控。P53P53在調(diào)節(jié)凋亡中起重要作用。正常細(xì)胞和在調(diào)節(jié)凋亡中起重要作用。正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞在受到紫外線或腫瘤細(xì)胞在受到紫外線或gammagamma射線照射后，含正射線照射后，含正常常p53p53的細(xì)胞，可發(fā)生凋亡，而的細(xì)胞，可發(fā)生凋亡，而p53p53基因缺失或突基因缺失或突變的細(xì)胞則表現(xiàn)出對電離射線和化療藥物的抗性變的細(xì)胞則表現(xiàn)出對電離射線和化療藥物的抗性。野生型。野生型p53p53對凋亡起促進(jìn)作用，突變型對凋亡起促進(jìn)作用，突變型p53p53對凋?qū)Φ?/p>

26、亡起抑制作用。亡起抑制作用。第28頁/共105頁第二十九頁，共105頁。細(xì)胞凋亡的基因細(xì)胞凋亡的基因(jyn)調(diào)控調(diào)控常見的凋亡基因及其蛋白：常見的凋亡基因及其蛋白：3 Fas3 Fas和和FasFas配體配體 Fas Fas是腫瘤壞死因子（是腫瘤壞死因子（TNFTNF）受體和神經(jīng)生長因子受體家族的細(xì)胞表）受體和神經(jīng)生長因子受體家族的細(xì)胞表面分子。面分子。FasFas配體（配體（Fas ligand,FasL)Fas ligand,FasL)是是TNFTNF家族的細(xì)胞表面分子。家族的細(xì)胞表面分子。FasLFasL與其受體與其受體FasFas結(jié)合導(dǎo)致攜帶結(jié)合導(dǎo)致攜帶(xidi)Fas(xidi)

27、Fas的細(xì)胞凋的細(xì)胞凋亡?？雇?。抗FasFas抗體、表達(dá)抗體、表達(dá)FasLFasL的細(xì)胞和可溶性的細(xì)胞和可溶性的的FasLFasL與與FasFas交聯(lián)均產(chǎn)生細(xì)胞凋亡信息，而交聯(lián)均產(chǎn)生細(xì)胞凋亡信息，而bcl-2bcl-2過度表達(dá)能抑制過度表達(dá)能抑制FasFas致凋亡作用。致凋亡作用。第29頁/共105頁第三十頁，共105頁。細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡(dio wn)與疾病與疾病細(xì)胞凋亡與腫瘤：細(xì)胞凋亡與腫瘤： 以往，細(xì)胞增殖的失調(diào)、細(xì)胞分化與增殖以往，細(xì)胞增殖的失調(diào)、細(xì)胞分化與增殖紊亂被認(rèn)為是惡性腫瘤的發(fā)生機(jī)制。近來，人紊亂被認(rèn)為是惡性腫瘤的發(fā)生機(jī)制。近來，人們認(rèn)識們認(rèn)識(rn shi)(rn shi)到

28、在腫瘤細(xì)胞快速增殖過程到在腫瘤細(xì)胞快速增殖過程中，同時也發(fā)生凋亡，增殖與凋亡之間的平衡中，同時也發(fā)生凋亡，增殖與凋亡之間的平衡有可能決定著腫瘤的生長速度。細(xì)胞凋亡的減有可能決定著腫瘤的生長速度。細(xì)胞凋亡的減少，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。少，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。第30頁/共105頁第三十一頁，共105頁。細(xì)胞細(xì)胞(xbo)凋亡與疾病凋亡與疾病細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡(dio wn(dio wn) )與腫瘤：與腫瘤： 凋亡凋亡(dio wn(dio wn) )調(diào)節(jié)基因的紊亂、凋調(diào)節(jié)基因的紊亂、凋亡亡(dio wn(dio wn) )機(jī)制蛋白的增加是腫瘤形成機(jī)制蛋白的增加是腫瘤形成的重要機(jī)

29、制。用于調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。用于調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡(dio (dio wnwn) )的基因主要有的基因主要有bcl-2bcl-2基因家族、基因家族、p53p53基因基因、FasFas基因家族和基因家族和c-mycc-myc基因家族?；蚣易?。第31頁/共105頁第三十二頁，共105頁。細(xì)胞細(xì)胞(xbo)凋亡與疾病凋亡與疾病細(xì)胞凋亡與腫瘤：細(xì)胞凋亡與腫瘤： 許多腫瘤，尤其是消化道腫瘤常可見許多腫瘤，尤其是消化道腫瘤?？梢姷蛲龅陌l(fā)生。凋亡在胃粘膜發(fā)生腸上皮化凋亡的發(fā)生。凋亡在胃粘膜發(fā)生腸上皮化生等病變中起決定性作用生等病變中起決定性作用(zuyng)(zuyng)，但，但胃癌的凋亡指數(shù)低于慢

30、性胃炎和胃潰瘍。胃癌的凋亡指數(shù)低于慢性胃炎和胃潰瘍。因此，胃粘膜病變細(xì)胞凋亡減少、生存期因此，胃粘膜病變細(xì)胞凋亡減少、生存期延長、細(xì)胞大量堆積可能是胃癌發(fā)生、浸延長、細(xì)胞大量堆積可能是胃癌發(fā)生、浸潤及轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。潤及轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。第32頁/共105頁第三十三頁，共105頁。細(xì)胞細(xì)胞(xbo)凋亡與疾病凋亡與疾病細(xì)胞凋亡與腫瘤：細(xì)胞凋亡與腫瘤： 凋亡還可能與胃癌的血管生成有關(guān)。凋亡指凋亡還可能與胃癌的血管生成有關(guān)。凋亡指數(shù)與腫瘤內(nèi)部微血管密度數(shù)與腫瘤內(nèi)部微血管密度(md)(md)成負(fù)相關(guān)，并成負(fù)相關(guān)，并與胃癌的組織類型有關(guān)。與胃癌的組織類型有關(guān)。第33頁/共105頁第三十四頁，共105頁。細(xì)胞凋亡

31、細(xì)胞凋亡(dio wn)與疾病與疾病細(xì)胞凋亡與免疫系統(tǒng)疾病細(xì)胞凋亡與免疫系統(tǒng)疾病(jbng)(jbng)： 許多以免疫功能異常為主要特征的疾許多以免疫功能異常為主要特征的疾病病(jbng)(jbng)均存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。細(xì)胞均存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。細(xì)胞凋亡在免疫形態(tài)的發(fā)生分化以及抗感染免凋亡在免疫形態(tài)的發(fā)生分化以及抗感染免疫和自身免疫病的發(fā)生中起重要作用。疫和自身免疫病的發(fā)生中起重要作用。第34頁/共105頁第三十五頁，共105頁。細(xì)胞細(xì)胞(xbo)凋亡與疾病凋亡與疾病細(xì)胞凋亡與免疫系統(tǒng)疾?。杭?xì)胞凋亡與免疫系統(tǒng)疾?。?當(dāng)?shù)蛲鲞^少、炎癥反應(yīng)過強(qiáng)時，易造成變當(dāng)?shù)蛲鲞^少、炎癥反應(yīng)過強(qiáng)時，易造成變態(tài)反應(yīng)或

32、自身免疫病。當(dāng)?shù)蛲鲞^多，機(jī)體免疫態(tài)反應(yīng)或自身免疫病。當(dāng)?shù)蛲鲞^多，機(jī)體免疫力下降時，容易繼發(fā)感染力下降時，容易繼發(fā)感染(gnrn)(gnrn)與腫瘤。與腫瘤。在細(xì)胞凋亡過程中，在細(xì)胞凋亡過程中，CD95(Fas)/CD95L(FasL)CD95(Fas)/CD95L(FasL)以以及及CD40/CD40LCD40/CD40L之間的相互作用起了重要作用。之間的相互作用起了重要作用。它們通過激活它們通過激活T T淋巴細(xì)胞的自殺或殺傷激活的淋巴細(xì)胞的自殺或殺傷激活的B B淋巴細(xì)胞，進(jìn)一步調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱。淋巴細(xì)胞，進(jìn)一步調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱。第35頁/共105頁第三十六頁，共105頁。細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡

33、(dio wn)與疾病與疾病細(xì)胞凋亡與免疫系統(tǒng)疾病：細(xì)胞凋亡與免疫系統(tǒng)疾?。?當(dāng)?shù)蛲鲞^少、炎癥反應(yīng)過強(qiáng)時，易造成變態(tài)當(dāng)?shù)蛲鲞^少、炎癥反應(yīng)過強(qiáng)時，易造成變態(tài)反應(yīng)或自身免疫病。當(dāng)?shù)蛲鲞^多，機(jī)體免疫力下反應(yīng)或自身免疫病。當(dāng)?shù)蛲鲞^多，機(jī)體免疫力下降時，容易繼發(fā)感染與腫瘤。在細(xì)胞凋亡過程降時，容易繼發(fā)感染與腫瘤。在細(xì)胞凋亡過程(guchng)(guchng)中，中，CD95(Fas)/CD95L(FasL)CD95(Fas)/CD95L(FasL)以及以及CD40/CD40LCD40/CD40L之間的相互作用起了重要作用。它們之間的相互作用起了重要作用。它們通過激活通過激活T T淋巴細(xì)胞的自殺或殺傷激活

34、的淋巴細(xì)胞的自殺或殺傷激活的B B淋巴細(xì)淋巴細(xì)胞，進(jìn)一步調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱。胞，進(jìn)一步調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱。第36頁/共105頁第三十七頁，共105頁。細(xì)胞細(xì)胞(xbo)凋亡與疾病凋亡與疾病細(xì)胞凋亡與免疫系統(tǒng)疾?。杭?xì)胞凋亡與免疫系統(tǒng)疾?。?近來研究近來研究(ynji)(ynji)發(fā)現(xiàn)，淋巴細(xì)胞凋發(fā)現(xiàn)，淋巴細(xì)胞凋亡作用的缺陷與系統(tǒng)性紅斑狼瘡（亡作用的缺陷與系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLESLE）的發(fā)）的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。淋巴細(xì)胞凋亡的缺陷生、發(fā)展有密切關(guān)系。淋巴細(xì)胞凋亡的缺陷常是自身基因調(diào)控異常的結(jié)果。目前已明確常是自身基因調(diào)控異常的結(jié)果。目前已明確定義為自身基因的有定義為自身基因的有FasFas和和b

35、cl-2bcl-2等。等。第37頁/共105頁第三十八頁，共105頁。細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡(dio wn)與疾病與疾病細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡(dio wn(dio wn) )與皮膚?。号c皮膚病： 某些皮膚病是以凋亡某些皮膚病是以凋亡(dio wn(dio wn) )的增加為的增加為特征。銀屑病表皮的基底膜上層中觀察到凋亡特征。銀屑病表皮的基底膜上層中觀察到凋亡(dio wn(dio wn) )的形態(tài)學(xué)和生化特征。的形態(tài)學(xué)和生化特征。plaqueplaque基底基底細(xì)胞層細(xì)胞層bcl-2bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)顯著下降。陽性細(xì)胞數(shù)顯著下降。第38頁/共105頁第三十九頁，共105頁。細(xì)胞細(xì)胞(xbo)凋亡與疾

36、病凋亡與疾病細(xì)胞凋亡與皮膚?。杭?xì)胞凋亡與皮膚?。?自身免疫性皮膚病，如皮肌炎、硬皮自身免疫性皮膚病，如皮肌炎、硬皮病等，其免疫異常與自身反應(yīng)性病等，其免疫異常與自身反應(yīng)性T T、B B淋巴淋巴細(xì)胞凋亡缺陷有關(guān)。惡性黑色素瘤的發(fā)生細(xì)胞凋亡缺陷有關(guān)。惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡基因調(diào)控失常而導(dǎo)致凋、發(fā)展與細(xì)胞凋亡基因調(diào)控失常而導(dǎo)致凋亡障礙有關(guān)。此外，細(xì)胞凋亡與皮膚腫瘤亡障礙有關(guān)。此外，細(xì)胞凋亡與皮膚腫瘤(zhngli)(zhngli)自動消退有關(guān)。自動消退有關(guān)。第39頁/共105頁第四十頁，共105頁。細(xì)胞細(xì)胞(xbo)凋亡與疾病凋亡與疾病缺血性腦損傷和缺血性心臟?。喝毖阅X損傷和缺血性心臟

37、?。?以往，腦缺血導(dǎo)致的細(xì)胞以往，腦缺血導(dǎo)致的細(xì)胞(xbo)(xbo)死死亡被認(rèn)為是由于神經(jīng)元廣泛壞死所致。近亡被認(rèn)為是由于神經(jīng)元廣泛壞死所致。近來研究表明，全腦或局部腦梗死均激活細(xì)來研究表明，全腦或局部腦梗死均激活細(xì)胞胞(xbo)(xbo)凋亡過程。大腦半球短暫缺血凋亡過程。大腦半球短暫缺血后，缺血中心區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞后，缺血中心區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞(xbo)(xbo)很快很快壞死，但周圍的神經(jīng)細(xì)胞壞死，但周圍的神經(jīng)細(xì)胞(xbo)(xbo)，以海，以海馬馬CAICAI區(qū)的錐形細(xì)胞區(qū)的錐形細(xì)胞(xbo)(xbo)最為明顯，最為明顯，要經(jīng)過一個潛伏期才出現(xiàn)延遲性神經(jīng)細(xì)胞要經(jīng)過一個潛伏期才出現(xiàn)延遲性神經(jīng)細(xì)胞(

38、xbo)(xbo)退化，即細(xì)胞退化，即細(xì)胞(xbo)(xbo)凋亡。凋亡。第40頁/共105頁第四十一頁，共105頁。細(xì)胞細(xì)胞(xbo)凋亡與疾病凋亡與疾病缺血性腦損傷和缺血性心臟?。喝毖阅X損傷和缺血性心臟?。?這種凋亡發(fā)生在缺血后這種凋亡發(fā)生在缺血后1-21-2天，并在缺血周邊天，并在缺血周邊區(qū)域出現(xiàn)區(qū)域出現(xiàn)bcl-2bcl-2蛋白的表達(dá)。而且，不僅在神經(jīng)細(xì)蛋白的表達(dá)。而且，不僅在神經(jīng)細(xì)胞，在膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血管胞，在膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血管壁中也有表達(dá)，這提示非致死性的損傷導(dǎo)致細(xì)胞壁中也有表達(dá)，這提示非致死性的損傷導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生產(chǎn)生bcl-2bcl-2，以抵抗細(xì)

39、胞的凋亡。此外，在缺血后，以抵抗細(xì)胞的凋亡。此外，在缺血后的腦組織中檢測到的腦組織中檢測到FasFas抗原抗原mRNAmRNA明顯增加，提示明顯增加，提示FasFas在凋亡中起一定在凋亡中起一定(ydng)(ydng)作用。作用。第41頁/共105頁第四十二頁，共105頁。細(xì)胞細(xì)胞(xbo)凋亡與疾病凋亡與疾病缺血性腦損傷和缺血性心臟?。喝毖阅X損傷和缺血性心臟?。?除了細(xì)胞壞死以外，凋亡也是缺血性心肌除了細(xì)胞壞死以外，凋亡也是缺血性心肌細(xì)胞死亡的重要方式。在體心臟實(shí)驗(yàn)表明，再細(xì)胞死亡的重要方式。在體心臟實(shí)驗(yàn)表明，再灌注損傷和心肌梗死均能誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡，灌注損傷和心肌梗死均能誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡

40、，尤其尤其(yuq)(yuq)在梗死早期。心肌梗死的大小取在梗死早期。心肌梗死的大小取決于細(xì)胞凋亡的嚴(yán)重程度，凋亡可能是缺血性決于細(xì)胞凋亡的嚴(yán)重程度，凋亡可能是缺血性心臟病演化為心力衰竭的細(xì)胞學(xué)機(jī)制。心臟病演化為心力衰竭的細(xì)胞學(xué)機(jī)制。第42頁/共105頁第四十三頁，共105頁。細(xì)胞細(xì)胞(xbo)凋亡與疾病凋亡與疾病感染性疾?。焊腥拘约膊。?HIV HIV感染可導(dǎo)致感染可導(dǎo)致AIDSAIDS。其感染的細(xì)胞學(xué)特征。其感染的細(xì)胞學(xué)特征是特異性破壞是特異性破壞CD4+TCD4+T淋巴細(xì)胞，造成相關(guān)免疫功淋巴細(xì)胞，造成相關(guān)免疫功能缺陷，導(dǎo)致感染和腫瘤。在能缺陷，導(dǎo)致感染和腫瘤。在HIVHIV感染過程中，

41、感染過程中，從從HIVHIV對對CD4+TCD4+T淋巴細(xì)胞黏附、病毒顆粒進(jìn)入細(xì)淋巴細(xì)胞黏附、病毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞、胞、HIVHIV基因組在細(xì)胞中復(fù)制和裝配以及出芽釋基因組在細(xì)胞中復(fù)制和裝配以及出芽釋放等環(huán)節(jié)放等環(huán)節(jié)(hunji)(hunji)，都與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，都與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。第43頁/共105頁第四十四頁，共105頁。細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡(dio wn)與疾病與疾病其他其他(qt)(qt)疾?。杭膊。?腎小球腎炎和狼瘡腎炎動物模型中均腎小球腎炎和狼瘡腎炎動物模型中均發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞，這些凋亡細(xì)胞可能與腎小發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞，這些凋亡細(xì)胞可能與腎小球硬化和腎功能衰竭有關(guān)。血管動脈粥樣球硬化和腎功能衰

42、竭有關(guān)。血管動脈粥樣硬化形成過程中，平滑肌細(xì)胞的增殖與凋硬化形成過程中，平滑肌細(xì)胞的增殖與凋亡同時存在，凋亡對內(nèi)皮損傷、增殖抑制亡同時存在，凋亡對內(nèi)皮損傷、增殖抑制、粥樣病灶的形成和斑塊的剝脫有一定的、粥樣病灶的形成和斑塊的剝脫有一定的影響。影響。 第44頁/共105頁第四十五頁，共105頁。細(xì)胞細(xì)胞(xbo)凋亡與疾病凋亡與疾病 通過對各種疾病細(xì)胞凋亡通過對各種疾病細(xì)胞凋亡(dio wn(dio wn) )的研究，使我們對疾病的發(fā)生機(jī)制有了新的認(rèn)的研究，使我們對疾病的發(fā)生機(jī)制有了新的認(rèn)識，同時也為疾病的治療提供了新的思路。識，同時也為疾病的治療提供了新的思路。 第45頁/共105頁第四十六頁

43、，共105頁。流式細(xì)胞分析流式細(xì)胞分析(fnx)細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征檢測形態(tài)學(xué)特征檢測 凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化是細(xì)胞發(fā)生凋凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化是細(xì)胞發(fā)生凋亡時最可靠的證據(jù)，其直接亡時最可靠的證據(jù)，其直接(zhji)(zhji)檢檢測方法主要是通過對組織或細(xì)胞進(jìn)行各種測方法主要是通過對組織或細(xì)胞進(jìn)行各種染色，然后在光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡下染色，然后在光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡下觀察。觀察。 第46頁/共105頁第四十七頁，共105頁。流式細(xì)胞流式細(xì)胞(xbo)分析細(xì)胞分析細(xì)胞(xbo)凋亡凋亡形態(tài)學(xué)特征檢測形態(tài)學(xué)特征檢測 凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化是細(xì)胞發(fā)生凋亡時最凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化是細(xì)胞發(fā)生凋亡時

44、最可靠的證據(jù)可靠的證據(jù)(zhngj)(zhngj)，其直接檢測方法主要是，其直接檢測方法主要是通過對組織或細(xì)胞進(jìn)行各種染色，然后在光學(xué)顯通過對組織或細(xì)胞進(jìn)行各種染色，然后在光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡下觀察。如通過蘇木素微鏡或電子顯微鏡下觀察。如通過蘇木素- -伊紅（伊紅（HE)HE)染色、吉姆薩（染色、吉姆薩（Giemsa)Giemsa)染色、甲基綠染色、甲基綠- -哌諾寧哌諾寧染色在普通光學(xué)顯微鏡下觀察；通過熒光染料如染色在普通光學(xué)顯微鏡下觀察；通過熒光染料如丫啶橙（丫啶橙（AO)AO)、Heochst33258Heochst33258染色在熒光顯微鏡下染色在熒光顯微鏡下觀察；或制成超薄切片用電

45、子顯微鏡觀察，以區(qū)觀察；或制成超薄切片用電子顯微鏡觀察，以區(qū)別凋亡和壞死。別凋亡和壞死。 第47頁/共105頁第四十八頁，共105頁。流式細(xì)胞分析流式細(xì)胞分析(fnx)細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征檢測形態(tài)學(xué)特征檢測 FCM FCM可間接觀察可間接觀察(gunch)(gunch)凋亡細(xì)胞形凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，主要是根據(jù)未經(jīng)染色的凋亡細(xì)胞態(tài)學(xué)變化，主要是根據(jù)未經(jīng)染色的凋亡細(xì)胞的光散射特征進(jìn)行檢測。的光散射特征進(jìn)行檢測。 第48頁/共105頁第四十九頁，共105頁。流式細(xì)胞分析流式細(xì)胞分析(fnx)細(xì)胞凋細(xì)胞凋亡亡形態(tài)學(xué)特征檢測形態(tài)學(xué)特征檢測 FCM FCM提供的散射光參數(shù)主要提供的散射光參數(shù)主要(z

46、hyo)(zhyo)包括前包括前向散射光（向散射光（FSCFSC）和測向散射光（）和測向散射光（SSCSSC）。）。FSCFSC主要主要(zhyo)(zhyo)與細(xì)胞大小有關(guān)，對同一個細(xì)胞群體與細(xì)胞大小有關(guān)，對同一個細(xì)胞群體，散射光強(qiáng)的，其細(xì)胞大一些，散射光弱的，其，散射光強(qiáng)的，其細(xì)胞大一些，散射光弱的，其細(xì)胞小一些。細(xì)胞小一些。SSCSSC主要主要(zhyo)(zhyo)與細(xì)胞內(nèi)部顆粒與細(xì)胞內(nèi)部顆粒密度有關(guān)，顆粒密度越大，密度有關(guān)，顆粒密度越大，SSCSSC就越大，而顆粒密就越大，而顆粒密度越小，度越小，SSCSSC就越小。就越小。 第49頁/共105頁第五十頁，共105頁。流式細(xì)胞分析流式

47、細(xì)胞分析(fnx)細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征檢測形態(tài)學(xué)特征檢測 當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，細(xì)胞膜完整、細(xì)胞當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，細(xì)胞膜完整、細(xì)胞皺縮，因此這一階段皺縮，因此這一階段(jidun)(jidun)凋亡細(xì)胞凋亡細(xì)胞FSCFSC較較活細(xì)胞小，而活細(xì)胞小，而SSCSSC較之增強(qiáng)或無明顯變化。較之增強(qiáng)或無明顯變化。 第50頁/共105頁第五十一頁，共105頁。流式細(xì)胞流式細(xì)胞(xbo)分析細(xì)胞分析細(xì)胞(xbo)凋亡凋亡形態(tài)學(xué)特征檢測形態(tài)學(xué)特征檢測 當(dāng)細(xì)胞凋亡進(jìn)一步發(fā)展時，細(xì)胞皺縮更當(dāng)細(xì)胞凋亡進(jìn)一步發(fā)展時，細(xì)胞皺縮更加明顯加明顯(mngxin)(mngxin)，核質(zhì)的變化導(dǎo)致細(xì)胞，核質(zhì)的變化導(dǎo)致

48、細(xì)胞內(nèi)顆粒密度明顯內(nèi)顆粒密度明顯(mngxin)(mngxin)增強(qiáng)，增強(qiáng)，F(xiàn)SCFSC進(jìn)一進(jìn)一步變小，而步變小，而SSCSSC卻明顯卻明顯(mngxin)(mngxin)增大。最增大。最終，當(dāng)?shù)蛲鲂◇w形成時，終，當(dāng)?shù)蛲鲂◇w形成時，F(xiàn)SCFSC明顯明顯(mngxin)(mngxin)縮小?？s小。 第51頁/共105頁第五十二頁，共105頁。流式細(xì)胞流式細(xì)胞(xbo)分析細(xì)胞分析細(xì)胞(xbo)凋亡凋亡形態(tài)學(xué)特征檢測形態(tài)學(xué)特征檢測 此外，也可通過此外，也可通過FSCFSC區(qū)分壞死細(xì)胞和凋區(qū)分壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。細(xì)胞壞死時，由于細(xì)胞腫脹亡細(xì)胞。細(xì)胞壞死時，由于細(xì)胞腫脹(zhngzhng)(zhngz

49、hng)，其，其FSCFSC增大，增大，SSCSSC在細(xì)胞在細(xì)胞壞死時也增大。但晚期凋亡細(xì)胞的壞死時也增大。但晚期凋亡細(xì)胞的FSCFSC和和SSCSSC與壞死細(xì)胞區(qū)分不明顯。當(dāng)壞死細(xì)胞的與壞死細(xì)胞區(qū)分不明顯。當(dāng)壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜破裂，核質(zhì)丟失，細(xì)胞成為碎片時細(xì)胞膜破裂，核質(zhì)丟失，細(xì)胞成為碎片時，其，其FSCFSC和和SSCSSC均明顯變小。均明顯變小。第52頁/共105頁第五十三頁，共105頁。流式細(xì)胞分析流式細(xì)胞分析(fnx)細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡第53頁/共105頁第五十四頁，共105頁。流式細(xì)胞分析流式細(xì)胞分析(fnx)細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征檢測形態(tài)學(xué)特征檢測 但實(shí)際上，由于被檢測細(xì)胞形態(tài)上

50、的均一但實(shí)際上，由于被檢測細(xì)胞形態(tài)上的均一性和核性和核/ /質(zhì)比例不同，凋亡不同階段的細(xì)胞，質(zhì)比例不同，凋亡不同階段的細(xì)胞，其光散射其光散射(snsh)(snsh)參數(shù)的變化不同，有時很參數(shù)的變化不同，有時很難準(zhǔn)確檢測到凋亡細(xì)胞。但將光散射難準(zhǔn)確檢測到凋亡細(xì)胞。但將光散射(snsh)(snsh)參數(shù)與熒光標(biāo)記的抗體或熒光染料參數(shù)與熒光標(biāo)記的抗體或熒光染料結(jié)合起來檢測細(xì)胞凋亡，可以克服單純的光散結(jié)合起來檢測細(xì)胞凋亡，可以克服單純的光散射射(snsh)(snsh)參數(shù)的缺點(diǎn)。參數(shù)的缺點(diǎn)。第54頁/共105頁第五十五頁，共105頁。流式細(xì)胞流式細(xì)胞(xbo)分析細(xì)胞分析細(xì)胞(xbo)凋亡凋亡細(xì)胞對染

51、料吸收能力的檢測細(xì)胞對染料吸收能力的檢測 凋亡細(xì)胞的一個重要特點(diǎn)是很長一段時間里凋亡細(xì)胞的一個重要特點(diǎn)是很長一段時間里細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)未受影響，其主要表現(xiàn)為：維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)未受影響，其主要表現(xiàn)為：維持(wich)(wich)膜的基本功能，如離子和大分子的屏膜的基本功能，如離子和大分子的屏蔽作用和具有功能的通道泵。蔽作用和具有功能的通道泵。第55頁/共105頁第五十六頁，共105頁。流式細(xì)胞分析流式細(xì)胞分析(fnx)細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡細(xì)胞對染料吸收能力的檢測細(xì)胞對染料吸收能力的檢測 根據(jù)不同功能狀態(tài)下的細(xì)胞對染料的吸收根據(jù)不同功能狀態(tài)下的細(xì)胞對染料的吸收或排斥作用不同，可用流式細(xì)胞儀定量或排斥作用不同，

52、可用流式細(xì)胞儀定量(dngling)(dngling)檢測活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死檢測活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的百分比。細(xì)胞的百分比。第56頁/共105頁第五十七頁，共105頁。流式細(xì)胞流式細(xì)胞(xbo)分析細(xì)胞分析細(xì)胞(xbo)凋亡凋亡細(xì)胞對染料吸收能力的檢測細(xì)胞對染料吸收能力的檢測 處于早處于早/ /中期的凋亡細(xì)胞，仍然保持著完整中期的凋亡細(xì)胞，仍然保持著完整的質(zhì)膜及其基本功能，阻礙大分子物質(zhì)的質(zhì)膜及其基本功能，阻礙大分子物質(zhì)(wzh)(wzh)及離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。而晚期凋亡細(xì)胞及離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。而晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞，其質(zhì)膜完整性受到破壞，使某些大或壞死細(xì)胞，其質(zhì)膜完整性受到破壞，使某些

53、大分子物質(zhì)分子物質(zhì)(wzh)(wzh)及離子可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。因及離子可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。因此，根據(jù)對此，根據(jù)對DNADNA染料通透性的不同，可區(qū)分處于染料通透性的不同，可區(qū)分處于不同階段的細(xì)胞。不同階段的細(xì)胞。第57頁/共105頁第五十八頁，共105頁。流式細(xì)胞流式細(xì)胞(xbo)分析細(xì)胞分析細(xì)胞(xbo)凋亡凋亡細(xì)胞對染料細(xì)胞對染料(rnlio)(rnlio)吸收能力的檢測吸收能力的檢測 PI PI和和EBEB均屬于插入性熒光染料均屬于插入性熒光染料(rnlio)(rnlio)，可選擇性的定量嵌入核酸雙螺，可選擇性的定量嵌入核酸雙螺旋的堿基之間，其熒光發(fā)射均為橙紅色，如果旋的堿基之間，其熒光發(fā)射均

54、為橙紅色，如果使用氬離子激光使用氬離子激光488nm488nm激發(fā)，激發(fā)，PIPI的發(fā)射光譜波的發(fā)射光譜波長在長在610-620nm610-620nm范圍，范圍，EBEB的發(fā)射光譜波長在的發(fā)射光譜波長在603-610nm603-610nm之間，二者可互相替代，但之間，二者可互相替代，但EBEB毒性毒性較大。較大。第58頁/共105頁第五十九頁，共105頁。流式細(xì)胞分析流式細(xì)胞分析(fnx)細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡細(xì)胞對染料吸收能力的檢測細(xì)胞對染料吸收能力的檢測 7- 7-氨基氨基- -放線菌素放線菌素D D（7-AAD7-AAD）主要以插入方）主要以插入方式與式與DNADNA鏈的鏈的G-CG-C堿基對

55、結(jié)合，其激發(fā)波長約為堿基對結(jié)合，其激發(fā)波長約為580nm580nm，最大發(fā)射波長為，最大發(fā)射波長為660nm660nm，由于其發(fā)射波長，由于其發(fā)射波長較大，可與藻紅蛋白（較大，可與藻紅蛋白（PEPE）結(jié)合，通過單一）結(jié)合，通過單一(dny)(dny)光譜光譜488nm488nm的激光光源激發(fā)，可以進(jìn)行的激光光源激發(fā)，可以進(jìn)行定量定量DNADNA和免疫熒光的雙參數(shù)分析。和免疫熒光的雙參數(shù)分析。第59頁/共105頁第六十頁，共105頁。流式細(xì)胞流式細(xì)胞(xbo)分析細(xì)胞分析細(xì)胞(xbo)凋亡凋亡細(xì)胞對染料吸收能力的檢測細(xì)胞對染料吸收能力的檢測 由于由于(yuy)EB(yuy)EB、PIPI和和7-

56、AAD7-AAD不能進(jìn)入不能進(jìn)入具有完整細(xì)胞膜的活細(xì)胞中，即正常細(xì)胞和具有完整細(xì)胞膜的活細(xì)胞中，即正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞在未固定時對這些染料是拒染的，凋亡細(xì)胞在未固定時對這些染料是拒染的，而壞死細(xì)胞胞膜完整性已破壞，可被染色。而壞死細(xì)胞胞膜完整性已破壞，可被染色。因此，這些染料可被用來鑒別死細(xì)胞和活細(xì)因此，這些染料可被用來鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞。胞。第60頁/共105頁第六十一頁，共105頁。流式細(xì)胞分析流式細(xì)胞分析(fnx)細(xì)胞凋細(xì)胞凋亡亡細(xì)胞對染料吸收能力的檢測細(xì)胞對染料吸收能力的檢測 赫斯特類染料（特別是赫斯特類染料（特別是HO33342)HO33342)檢測檢測細(xì)胞凋亡的原理與上述染料不同。細(xì)

57、胞凋亡的原理與上述染料不同。HO33342HO33342是雙苯并咪唑家族成員之一，能特異與是雙苯并咪唑家族成員之一，能特異與DNADNA螺旋中富含螺旋中富含A-TA-T重復(fù)序列結(jié)合。重復(fù)序列結(jié)合。HO33342HO33342用用氪激光激發(fā)氪激光激發(fā)(jf)(jf)紫外線熒光，激發(fā)紫外線熒光，激發(fā)(jf)(jf)光波長為光波長為352nm352nm，發(fā)射光波長為，發(fā)射光波長為400-500nm400-500nm，產(chǎn)生藍(lán)色熒光。，產(chǎn)生藍(lán)色熒光。第61頁/共105頁第六十二頁，共105頁。流式細(xì)胞流式細(xì)胞(xbo)分析細(xì)胞分析細(xì)胞(xbo)凋亡凋亡細(xì)胞對染料吸收能力的檢測細(xì)胞對染料吸收能力的檢測 H

58、O33342 HO33342能被活細(xì)胞攝取，而其從細(xì)胞內(nèi)排能被活細(xì)胞攝取，而其從細(xì)胞內(nèi)排出是一個耗能的主動過程，依賴細(xì)胞膜上的出是一個耗能的主動過程，依賴細(xì)胞膜上的P-P-糖糖蛋白泵?；罴?xì)胞染色時，應(yīng)考慮是否存在細(xì)胞抗蛋白泵。活細(xì)胞染色時，應(yīng)考慮是否存在細(xì)胞抗藥性問題藥性問題(wnt)(wnt)，如有耐藥性，則染色效果，如有耐藥性，則染色效果不佳。不佳。HO33342HO33342進(jìn)入凋亡細(xì)胞比正常細(xì)胞多，將進(jìn)入凋亡細(xì)胞比正常細(xì)胞多，將其與其與PIPI結(jié)合對凋亡細(xì)胞進(jìn)行雙染，可將正常細(xì)胞結(jié)合對凋亡細(xì)胞進(jìn)行雙染，可將正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)分開來。、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)分開來。第62頁/共

59、105頁第六十三頁，共105頁。流式細(xì)胞分析流式細(xì)胞分析(fnx)細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡細(xì)胞對染料吸收能力的檢測細(xì)胞對染料吸收能力的檢測(jin c)(jin c) 在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，這三群細(xì)在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，這三群細(xì)胞表現(xiàn)為：正常細(xì)胞低藍(lán)光胞表現(xiàn)為：正常細(xì)胞低藍(lán)光/ /低紅光，凋亡細(xì)胞低紅光，凋亡細(xì)胞為高藍(lán)光為高藍(lán)光/ /低紅光，壞死細(xì)胞為低藍(lán)光低紅光，壞死細(xì)胞為低藍(lán)光/ /高紅光。高紅光。第63頁/共105頁第六十四頁，共105頁。流式細(xì)胞分析流式細(xì)胞分析(fnx)細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡caspasecaspase的流式細(xì)胞儀檢測的流式細(xì)胞儀檢測 caspase caspase

60、家族在細(xì)胞凋亡過程中起著重要作家族在細(xì)胞凋亡過程中起著重要作用，通過用，通過caspasecaspase對大分子結(jié)構(gòu)的瀑布級聯(lián)水解對大分子結(jié)構(gòu)的瀑布級聯(lián)水解反應(yīng)，導(dǎo)致凋亡發(fā)生。其中反應(yīng)，導(dǎo)致凋亡發(fā)生。其中caspase-3caspase-3是最重要是最重要的指示蛋白酶，活化的的指示蛋白酶，活化的caspase-3caspase-3可以可以(ky)(ky)蛋白水解切割和激活其他的蛋白水解切割和激活其他的caspasecaspase、相關(guān)胞質(zhì)、相關(guān)胞質(zhì)的靶位點(diǎn)（的靶位點(diǎn)（CK18CK18）等。）等。Caspase-3Caspase-3切割細(xì)胞因子切割細(xì)胞因子，尤其是，尤其是CK18CK18，是凋亡