無菌檢驗(yàn)方法適用性試驗(yàn)方案

1、無菌檢驗(yàn)方法適用性試驗(yàn)方案目錄1 .概述試驗(yàn)背景為保證無菌檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，當(dāng)建立產(chǎn)品的無菌檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法的適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)供試品在該實(shí)驗(yàn)條件下無抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不計(jì)，所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無菌檢查。按照中國藥典2015年版四部“通則1101無菌檢查法”要求，檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，檢查方法應(yīng)進(jìn)行重新試驗(yàn)。根據(jù)2015年版藥典及藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則要求，檢測環(huán)境由原來的為C級(jí)背景下局部 A級(jí)空氣單向流，在層流凈化工作臺(tái)下進(jìn)行無菌檢測，變更為在C級(jí)背景下，無菌檢查ORABS鬲離系統(tǒng)中進(jìn)彳T無菌檢測，且由原來的臭氧消毒，變更為臭氧+過氧化氫滅

2、菌 消毒；培養(yǎng)基發(fā)生變更：由培養(yǎng)真菌用的改良馬丁培養(yǎng)基變更為胰酪大豆月東液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度由23-28 C變更為20-25 C,現(xiàn)針對(duì)XXX注射液進(jìn)行適用性試驗(yàn)，以證明所采用的方 法適合該藥品的無菌檢查。方案說明驗(yàn)證過程中嚴(yán)格按照經(jīng)批準(zhǔn)的方案規(guī)定的內(nèi)容進(jìn)行，若因特殊原因需要變更時(shí)，應(yīng)填寫方案變更申請及批準(zhǔn)書，報(bào)試驗(yàn)領(lǐng)導(dǎo)小組批準(zhǔn)。2 .確認(rèn)目的按照中國藥典2015年版四部“通則1101無菌檢查法”規(guī)定對(duì)小兒氨基酸注射液無 菌檢查方法進(jìn)行試驗(yàn)， 在現(xiàn)有檢驗(yàn)程序、 檢測條件及培養(yǎng)條件下，對(duì)該供試品的適用性試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)，證明所采用的方法適合該藥品的無菌檢查。驗(yàn)證過程中應(yīng)嚴(yán)格按照本方案規(guī)定的內(nèi)容進(jìn)行，

3、若因特殊原因確需變更時(shí)， 應(yīng)填寫驗(yàn)證方案變更申請及批準(zhǔn)書，報(bào)驗(yàn)證領(lǐng)導(dǎo)小組批準(zhǔn)。3 .小組人員4 .風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)A.嚴(yán)重程度（S）:測定風(fēng)險(xiǎn)的潛在后果，分為以下四級(jí)：評(píng)分嚴(yán)重程度描述4關(guān)鍵直接影響產(chǎn)品質(zhì)量要素或工藝與質(zhì)量數(shù)據(jù)的可靠性、完整莊或可追蹤性，可能導(dǎo)致產(chǎn)品不能使用，直接影響GMPM則，危害生產(chǎn)區(qū)活動(dòng)。3高直接影響產(chǎn)品質(zhì)量要素或工藝與質(zhì)量數(shù)據(jù)的可靠性、完整莊或可追蹤性，可能導(dǎo)致產(chǎn)品召回或退回， 未能符合一些 GMP（則，可能引起檢查或?qū)徲?jì)中產(chǎn)生偏差。2中（/、重要的）對(duì)產(chǎn)品或數(shù)據(jù)無相關(guān)影響，但間接影響產(chǎn)品質(zhì)量要素或工藝與 質(zhì)量數(shù)據(jù)的可靠性、完整莊或可追蹤性，可能造成資源的嚴(yán)重 浪

4、費(fèi)或?qū)ζ髽I(yè)形象產(chǎn)生較壞影響。1低（可以忽略）對(duì)產(chǎn)品或數(shù)據(jù)無相關(guān)影響，但對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量要素或工藝與質(zhì)量數(shù) 據(jù)的可靠性、完整性或可追蹤性仍產(chǎn)生較小影響。B.可能性程度（P）:測定風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)生的可能性，為建立統(tǒng)一基線，建立以下四個(gè)等級(jí):評(píng)分可能性描述4極高極易發(fā)生，約一星期一次或者更頻繁3高偶爾發(fā)生，約一個(gè)月一次2中很少發(fā)生，約一年一次1低發(fā)生可能性極低，三年甚至更長時(shí)間都/、大可能發(fā)生C.檢測能力（D）:在潛在風(fēng)險(xiǎn)造成危害前，檢測發(fā)現(xiàn)的可能性，設(shè)為以下四個(gè)等級(jí):評(píng)分檢測能力描述4極低失敗很可能被忽視，因此沒有檢測到（無檢測機(jī)制，無人工或視覺校驗(yàn)）3低不檢測，但可能被發(fā)現(xiàn)，如：作為現(xiàn)場檢查的審計(jì)2中定期檢測

5、，如：常規(guī)的手動(dòng)控制或分析可檢測到錯(cuò)誤1高始終檢測到，如：自動(dòng)控制裝置到位，故障報(bào)警或錯(cuò)誤后無法下一流程操作風(fēng)險(xiǎn)分析及評(píng)價(jià)：根據(jù)確定的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)已經(jīng)識(shí)別并分析的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，即通過評(píng)價(jià)風(fēng)險(xiǎn)的嚴(yán)重性和可能性從而確認(rèn)風(fēng)險(xiǎn)的等級(jí)。質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)優(yōu)先級(jí)別評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如下：RPN嚴(yán)重程度風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別風(fēng)險(xiǎn)處理優(yōu)先等級(jí)RPN 16 或 S=4高等風(fēng)險(xiǎn)高優(yōu)先8WRPNC 16中等風(fēng)險(xiǎn)優(yōu)先RPNC 7低等風(fēng)險(xiǎn)忽略風(fēng)險(xiǎn)優(yōu)先系數(shù)（RPN計(jì)算：嚴(yán)重程度（S） x可能性程度（P） x檢測能力（口。風(fēng)險(xiǎn)水平的劃分：RPN16或嚴(yán)重程度=4高風(fēng)險(xiǎn)水平：此為不可接受風(fēng)險(xiǎn)。必須盡快采用控制措施，通過提高可檢測性及/或降低風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)生的可能性來降

6、低最終風(fēng)險(xiǎn)水平。驗(yàn)證應(yīng)首先集中于確認(rèn)已采用控制措施且持續(xù)執(zhí)行。由嚴(yán)重程度為4導(dǎo)致的高風(fēng)險(xiǎn)水平，必須將其降低至RPN最大=8。 16RPN8中等風(fēng)險(xiǎn)水平：此風(fēng)險(xiǎn)要求采用控制措施，通過提高可檢測性及/或降低風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)生的可能性來降低最終風(fēng)險(xiǎn)水平。所采用的措施可以是規(guī)程或技術(shù)措施，但均應(yīng)經(jīng)過驗(yàn)證。 RPNK7低風(fēng)險(xiǎn)水平：此風(fēng)險(xiǎn)水平為可接受，無需采用額外的控制措施。風(fēng)險(xiǎn)的確認(rèn)無菌檢查結(jié)果不成立風(fēng)險(xiǎn)的分析及評(píng)價(jià)依據(jù)風(fēng)險(xiǎn)分析及評(píng)價(jià)結(jié)果需實(shí)施的確認(rèn)項(xiàng)目 .試驗(yàn)前準(zhǔn)備文件確認(rèn)序號(hào)文件/資料編p存放地點(diǎn)123456檢查人：檢查日期:復(fù)核人：復(fù)核日期:.儀器確認(rèn): 確認(rèn)檢測設(shè)備已經(jīng)檢定并在有效期內(nèi)使用。確認(rèn)檢測設(shè)備運(yùn)

7、行良好，且滿足檢測需要。設(shè)備名稱型號(hào)編P檢定后效期至運(yùn)行檢查智能集菌儀培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱檢查人：檢查日期:復(fù)核人：復(fù)核日期:物料、培養(yǎng)基和沖洗液的確認(rèn)確認(rèn)物料、培養(yǎng)基是否在有效期內(nèi)使用確認(rèn)物料、培養(yǎng)基儲(chǔ)存條件、性狀符合要求。品名（試驗(yàn)物料）規(guī)格批號(hào)后效期生產(chǎn)1家集菌培養(yǎng)器品名（已配制培養(yǎng)基）固體批號(hào)廠家配制日期批號(hào)后效期硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基胰酪大豆月東液體培養(yǎng)基沙氏葡,萄糖肉湯培養(yǎng)基沙氏葡.萄糖瓊脂培養(yǎng)基%菌氯化鈉溶液% （v/v ）聚山梨酯80的尢菌氯化鈉溶液胰酪大豆月東瓊脂培養(yǎng)基沙氏葡.萄糖瓊脂培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)及靈敏度實(shí)驗(yàn)檢查確認(rèn)培養(yǎng)基已經(jīng)預(yù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，并預(yù)培養(yǎng)合格。確認(rèn)培養(yǎng)基已經(jīng)靈敏度試驗(yàn)檢查，并合

8、格。預(yù)培養(yǎng)：胰酪大豆臍液體培養(yǎng)基見XXXXXX硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基見XXXXXX品名批號(hào)培養(yǎng)日期培養(yǎng)條件操作人結(jié)果判斷胰酪大豆月東液體培養(yǎng)基H 時(shí) H 時(shí)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基H 時(shí) H 時(shí)靈敏度實(shí)驗(yàn)：胰酪大豆月東液體培養(yǎng)基見【硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基見【XXXXXXXXXXXX品名批號(hào)培養(yǎng)日期培養(yǎng)條件操作人結(jié)果判斷胰酪大豆月東液體培養(yǎng)基H 時(shí) H 時(shí)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基H 時(shí) H 時(shí)菌種確認(rèn)：確認(rèn)菌種有效期在合格范圍內(nèi)。名稱代數(shù)編R金黃色葡萄球菌大腸埃布國枯草芽抱桿菌生抱梭菌白色念珠菌黑曲霉6.菌液制備.接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽抱桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆月東瓊脂培養(yǎng)基上，接種生抱梭

9、菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30? 35 C培養(yǎng)18? 2 4小時(shí)；取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽抱桿菌斜面菌苔至3mlXXX注射液中混勻，取 1ml至空比濁管與標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，以至即為100。取100菌液1ml,加入9ml %無菌氯化鈉溶液中，做為10-1稀釋液，依次稀釋至 10-8。取10-510-8稀釋級(jí)按平皿計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)菌落數(shù)，根據(jù) 結(jié)果取菌落數(shù)小于 100cfu的稀釋級(jí)作為試驗(yàn)菌液。接種生抱梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30? 35 C培養(yǎng)18? 2 4小時(shí)后，取上述培養(yǎng)物1ml,加入9ml %無菌氯化鈉溶液中，做為10-1稀釋級(jí)，依次稀釋至10-8o取1

10、05 10-8稀釋級(jí)按平皿計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)菌落數(shù)，根據(jù)結(jié)果取菌落數(shù)小于100cfu的稀釋級(jí)作為試20驗(yàn)菌液。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上,? 25 C培養(yǎng)24? 4 8小時(shí)，上述培養(yǎng)物用0. 9%無菌氯化鈉溶液制成每lm l含菌數(shù)小于lOOcfu(菌落形成單位)的菌懸液。取上述培養(yǎng)物1ml,加入9ml炕菌氯化鈉溶液中，做為10-1稀釋級(jí)，依次稀釋至 108 0取10-510-8稀釋級(jí)按平皿計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)菌落數(shù)，根據(jù)結(jié)果取菌 落數(shù)小于100cfu的稀釋級(jí)作為試驗(yàn)菌液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上， 20? 25。C培養(yǎng)5? 7天，加人 3

11、? 5m l含% (ml/ml)聚山梨酯80的0. 9 %無菌氯化鈉溶液，將抱子洗脫。然后，用管口帶 有能過濾菌絲的裝置(如薄的無菌棉花或紗布的無菌毛細(xì)吸管)吸出抱子懸液至無菌試管內(nèi)，用含(m l/m l)聚山梨醋80的0. 9 %無菌氯化鈉溶液加入 炕菌氯化鈉溶?中，作為 10-1 稀釋級(jí)。依次稀釋至 10-8。取10-410-8稀釋級(jí)按平皿計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)菌落數(shù)，根據(jù)結(jié)果取菌 落數(shù)小于100cfu/ml的稀釋級(jí)作為試驗(yàn)菌液。計(jì)數(shù)結(jié)果取上述各稀釋級(jí)各種菌懸液或抱子懸液1ml,分別用融化后45c左右的胰酪大豆月東瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基15ml20ml注皿，各平行測定兩皿。胰酪大豆月東瓊脂培

12、養(yǎng)基在3035c培養(yǎng)48小時(shí)，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基在2025c培養(yǎng)72小時(shí)，計(jì)數(shù)l。表1平皿計(jì)數(shù)法，各對(duì)照菌菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，單位： cfu/ml菌種金黃色葡萄球菌大腸埃布國枯草芽抱桿菌生抱梭菌白色念珠菌黑曲霉菌稀釋級(jí)計(jì)數(shù)平均正式試驗(yàn)樣品信息:產(chǎn)品名稱規(guī)格包裝形式玻瓶火菌條件批號(hào)1肩效期至1批號(hào)2肩效期至2批號(hào)3肩效期至3生產(chǎn)單位試驗(yàn)步驟：產(chǎn)品試驗(yàn)：取同一批次的供試品60瓶，分成六組，每組10瓶。共取三個(gè)批次，共計(jì) 18組。產(chǎn)品試驗(yàn)：將同一批次的供試品60瓶分六組，每組10瓶。按薄膜過濾法將一組供試液過濾至一只濾筒內(nèi)，過濾完畢，加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆月東液體培養(yǎng)基，然后加入小于100c

13、fu/ml的試驗(yàn)菌。另一管濾加入同等體積同種培養(yǎng)基，再加入等量試驗(yàn)菌，作為對(duì)照。按規(guī)定溫度培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間不得超過5天。各試驗(yàn)菌同法操作。重復(fù)上述操作，做完另五組供試液。重復(fù)三批試驗(yàn)。每個(gè)試驗(yàn)菌每天只需做一次陽性對(duì)照。結(jié)果判斷：與對(duì)照管比較，如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)，照此檢驗(yàn)法和檢驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用，應(yīng)采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進(jìn)行

14、方法適用性試驗(yàn)試驗(yàn)依據(jù)：按無菌檢查法（中國藥典2015年版四部通則1101）的薄膜過濾法。培養(yǎng)溫度：細(xì)菌培養(yǎng)溫度：3035C、真菌培養(yǎng)溫度：2025 c 記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果7 .試驗(yàn)結(jié)果與評(píng)價(jià)：各工作人員應(yīng)如實(shí)記錄各項(xiàng)結(jié)果，并及時(shí)將數(shù)據(jù)提交驗(yàn)證小組，驗(yàn)證小組對(duì)其分析匯總后，做出相應(yīng)客觀評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)人：日期：8 .試驗(yàn)過程中的偏差處理在確認(rèn)過程中，對(duì)于不合格的項(xiàng)目，應(yīng)進(jìn)行有針對(duì)性的分析，查明原因及時(shí)整改，并對(duì)該項(xiàng)目重復(fù)確認(rèn)，直至達(dá)到方案要求為止。驗(yàn)證名稱：方案編號(hào)：偏離/不符合評(píng)價(jià):接收（Yes/No）日期： 評(píng)價(jià)人：9 .再試驗(yàn)周期：檢驗(yàn)程序或條件、產(chǎn)品組分發(fā)生變化時(shí)包裝形式及滅菌條件發(fā)生變化時(shí)當(dāng)陽性試驗(yàn)不成立時(shí)；10 .批準(zhǔn)由公司確認(rèn)領(lǐng)導(dǎo)小組負(fù)責(zé)人根據(jù)具體確認(rèn)結(jié)果對(duì)小兒氨基酸注射液無菌檢驗(yàn)方法的有 效性作出批示。表1產(chǎn)品試驗(yàn)組、陽