RedET同源重組技術(shù)概述

1、Red/ETRed/ET同源重組技術(shù)同源重組技術(shù)20152015年年3 3月月2525日日 內(nèi)內(nèi) 容容一、一、 什么是什么是Red/ET同源重組同源重組二、二、 技術(shù)的特點(diǎn)技術(shù)的特點(diǎn)三、三、 作用機(jī)制作用機(jī)制四、四、 功能元件功能元件五、操作流程及關(guān)鍵因素五、操作流程及關(guān)鍵因素六、在基因工程中的主要應(yīng)用六、在基因工程中的主要應(yīng)用七、七、 新技術(shù)的發(fā)展新技術(shù)的發(fā)展八、在其他細(xì)菌中的應(yīng)用八、在其他細(xì)菌中的應(yīng)用 遺遺 傳傳 重重 組組 基因組的可變性和穩(wěn)定性之間必須維持一個(gè)恰到好處的平衡，這樣才能使生物體得以生存并能世代相傳，繁衍不息。 染色體的遺傳差異主要由兩種 機(jī)制產(chǎn)生，一種是突變，一種是遺傳重

2、組。 重組可分為四類（重組可分為四類（DNA序列、蛋白質(zhì)因子）序列、蛋白質(zhì)因子） 狹義遺傳重組：涉及到狹義遺傳重組：涉及到DNA分子內(nèi)斷裂分子內(nèi)斷裂-復(fù)合的基因交流復(fù)合的基因交流 遺傳重組與重組遺傳重組與重組DNA技術(shù)技術(shù) 異常異常廣義遺傳重組：任何造成基因型變化的基因交流過程廣義遺傳重組：任何造成基因型變化的基因交流過程一、一、 什么是什么是Red/ET同源重組同源重組1. 1. 概念概念 Red/ET Red/ET重組是新近出現(xiàn)的一種利用來自重組是新近出現(xiàn)的一種利用來自E. coliE. coli中中 噬菌體噬菌體的重組的重組酶酶RedRed/Red/Red 或者是來自或者是來自 Rac

3、Rac 噬菌體噬菌體的重組酶的重組酶RecE/RecT RecE/RecT 進(jìn)行基因同進(jìn)行基因同源重組的源重組的DNADNA工程技術(shù)。工程技術(shù)。2. 2. 原理原理 首先重組酶沿53方向方向消化雙鏈DNA，露出粘性末端（15-50bp15-50bp）。隨后重組酶介導(dǎo)單鏈退火修復(fù)單鏈退火修復(fù)（single- strand annealingsingle- strand annealing），即載體和），即載體和插入片段的黏性末端（插入片段的黏性末端（15-50bp15-50bp） 互補(bǔ)形成穩(wěn)定的帶缺刻的環(huán)狀重組質(zhì)粒，互補(bǔ)形成穩(wěn)定的帶缺刻的環(huán)狀重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后能自動(dòng)被修復(fù)為閉合的環(huán)狀質(zhì)粒轉(zhuǎn)

4、化大腸桿菌后能自動(dòng)被修復(fù)為閉合的環(huán)狀質(zhì)粒3. 3. 特點(diǎn)：特點(diǎn)： RedRed同源重組技術(shù)具有同源重組技術(shù)具有同源序列短同源序列短(15(1550bp)50bp)、重組效率高重組效率高、操、操作作簡單簡單、快速快速的特點(diǎn)。的特點(diǎn)。4. 4. 應(yīng)用應(yīng)用 這種技術(shù)可在這種技術(shù)可在DNADNA靶標(biāo)分子的任意位點(diǎn)進(jìn)行靶標(biāo)分子的任意位點(diǎn)進(jìn)行基因敲除基因敲除、敲入敲入、點(diǎn)突點(diǎn)突變變等操作等操作, ,無需使用限制性內(nèi)切酶和連接酶。此外無需使用限制性內(nèi)切酶和連接酶。此外, ,這種新型重組技術(shù)可這種新型重組技術(shù)可直接將直接將目的基因克隆到載體上目的基因克隆到載體上, ,目的基因既可來源于細(xì)菌人工染色體也目的基因

5、既可來源于細(xì)菌人工染色體也可是基因組可是基因組DNADNA。RedRed同源重組技術(shù)使難度較大的基因工程實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行同源重組技術(shù)使難度較大的基因工程實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行, ,大大推動(dòng)功能基因組研究的發(fā)展。大大推動(dòng)功能基因組研究的發(fā)展。g b al phageETRac phageu Rac recE/recT 操縱子操縱子 = red 操縱子操縱子, 操縱子中的重組酶操縱子中的重組酶（Red/Red 或者或者RecE/RecT）協(xié)同配合完成重組作用；）協(xié)同配合完成重組作用； u recE = red ：53 dsDNA核酸外切酶；核酸外切酶； u recT = red ：ssDNA結(jié)合和退火蛋白；結(jié)合

6、和退火蛋白； u red： 防止防止 E. coli中的核酸酶中的核酸酶 RecBCD對(duì)外源線性對(duì)外源線性DNA片片段的消化。段的消化。噬菌體的pL操縱子示意圖 Reda a(RecE)Red同源重組原理示意圖Single-strand annealingStrand invasion35Digestion Binding35Redb b(RecT)Repair/ReplicationSelectionRecE/RecT和Red/Red兩重組系統(tǒng)的差異 u “線狀線狀DNA線狀線狀DNA”重組，選用重組，選用RecE/RecT重組酶系統(tǒng)；重組酶系統(tǒng)；u “線狀線狀DNA環(huán)狀環(huán)狀DNA”重組，選

7、用重組，選用Red/Red重組酶系統(tǒng)；重組酶系統(tǒng)；u 根據(jù)需要選擇含不同抗生素抗性基因（根據(jù)需要選擇含不同抗生素抗性基因（Ampr、Hygr、Tetr）和不同）和不同的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（pBAD、pTet）的重組酶系統(tǒng)表達(dá)質(zhì)粒。）的重組酶系統(tǒng)表達(dá)質(zhì)粒。 質(zhì)粒: l pSC101-BAD-gbaA(amp)l pSC101-BAD-gbaA(tet)l pSC101-BAD-gbaA(hyg)l pSC101-Tet-gbaA(tet)l pSC101-BAD-ETgA(tet)l pSC101-Tet-ETgA (amp)RecE/RecT和Red/Red兩重組系統(tǒng)對(duì)不同類型底物重

8、組效率的差異 RedRed同源重組技術(shù)相關(guān)文獻(xiàn)同源重組技術(shù)相關(guān)文獻(xiàn)Nature Genetics (1998)Nature Biotechnology (2000)1. 不依賴RecA蛋白，在重組酶系統(tǒng)（Red/Red或RecE/RecT）的相互配合下，含短同源臂（1550bp）的供體DNA分子能直接重組到受體DNA分子上，實(shí)現(xiàn)替換、插入、刪除、突變等；2. 不受靶標(biāo)DNA分子大小的限制；3. 不受內(nèi)切酶切位點(diǎn)的限制；4. 精確性：不依賴RecA蛋白，減少了引入非預(yù)期的突變、 缺失、替換等的幾率； 5. 簡便快捷：省去了中間質(zhì)粒的構(gòu)建，減少實(shí)驗(yàn)步驟、縮短實(shí)驗(yàn)周期。二、二、Red/ET同源重組技

9、術(shù)的特點(diǎn)同源重組技術(shù)的特點(diǎn)三、三、 Red/ET重組的作用機(jī)制重組的作用機(jī)制Red/ET重組鏈入侵模型1.鏈入侵模式Red/ET同源重組鏈退火模型同源重組鏈退火模型2.鏈退火模型四、四、 Red/ET重組中的功能元件重組中的功能元件1. Red、Red和RedRed：以三聚體的形式形成“漏斗型”活性的蛋白， 5-3外切酶活性。Red結(jié)構(gòu)（A）和與DNA相互作用的模式（B）（圖片來自Subramanian et al. 2003） Red：與ssDNA結(jié)合形成絲狀體，催化與互補(bǔ)ssDNA之間的退火。 Red：抑制RecBCD外切酶和SbcCD外切酶對(duì)外源DNA的降解。 2. RecE和RecTR

10、ecE：C端39kDa的部分才是5-3外切酶活性必需，對(duì)5端為羥基的底物也有活性。 RecT：與ssDNA結(jié)合形成絲狀體，催化與互補(bǔ)ssDNA之間的退火。3. RecA 個(gè)亞基形成有活性的RecA蛋白，細(xì)菌中廣泛存在且高度保守，有同源重組酶、DNA損傷修復(fù)、DNA依賴ATPase活性等功能。 可誘導(dǎo)SOS反應(yīng)、挽救DNA復(fù)制叉等，提高電擊后細(xì)胞的活力，增加電轉(zhuǎn)化效率。五、五、 Red/ET重組操作流程重組操作流程引物設(shè)引物設(shè)計(jì)合成計(jì)合成線性供體線性供體dsDNA底物的制備底物的制備線性載體的線性載體的制備制備重組反應(yīng)重組反應(yīng)重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞至感受態(tài)細(xì)胞重組子重組子篩選篩選重

11、組子檢測重組子檢測1. 設(shè)計(jì)合成引物設(shè)計(jì)合成引物 設(shè)計(jì)引物時(shí)要遵循一般引物設(shè)計(jì)的基本原則，但是上下游引物要加上15-20bp的載體同源序列。載體同源序列如何添加主要分以下兩種情況：（1）載體酶切后是5端突出或平末端，則引物上的同源序列包括5端突出序列的同源序列。（2）載體酶切后是3端突出，則引物上的同源序列不包括3端突出序列的同源序列。引物設(shè)計(jì)方法引物設(shè)計(jì)方法同源臂長度對(duì)Red/ET重組效率的影響（數(shù)據(jù)來自Zhang et al. 1998） 同源臂的長度在1550bp時(shí)，重組效率就能滿足實(shí)驗(yàn)要求，重組效率隨著同源臂長度的增加而增加。2. 線性供體線性供體dsDNA底物的制備底物的制備u 選用

12、保真度高的選用保真度高的DNA聚合酶聚合酶（如（如Phusion、Pyrobest等，減少等，減少PCR反應(yīng)中的突變；擴(kuò)增反應(yīng)中的突變；擴(kuò)增GC含量較高的含量較高的DNA片段時(shí)，選用片段時(shí)，選用Triplemaster、HotStarTaq 等），等），用合成的引物用合成的引物PCR擴(kuò)增獲得擴(kuò)增獲得dsDNA底物；底物；u 純化純化PCR產(chǎn)物：產(chǎn)物： （1）減少模板背景對(duì)篩選工作帶來的難度；）減少模板背景對(duì)篩選工作帶來的難度； （2）降低其剩余引物與靶標(biāo)）降低其剩余引物與靶標(biāo)DNA片段的結(jié)合，提高重組效率；片段的結(jié)合，提高重組效率； （3）去處）去處PCR產(chǎn)物中的鹽離子，提高轉(zhuǎn)化效率。產(chǎn)物中的

13、鹽離子，提高轉(zhuǎn)化效率。u 降低模板對(duì)篩選工作帶來的難度；降低模板對(duì)篩選工作帶來的難度； （1）純化回收）純化回收PCR產(chǎn)物；產(chǎn)物； （2）內(nèi)切酶消化處理模板；）內(nèi)切酶消化處理模板； （3）使用）使用R6K復(fù)制子。復(fù)制子。 線性化載體可以通過線性化載體可以通過酶切酶切或或PCR擴(kuò)增擴(kuò)增兩種方法獲得。兩種方法獲得。1）酶切）酶切 選取合適的位點(diǎn)，單酶切或雙酶切皆可選取合適的位點(diǎn)，單酶切或雙酶切皆可, ,質(zhì)粒的線性化不徹底，將導(dǎo)致陰性質(zhì)粒的線性化不徹底，將導(dǎo)致陰性克隆的產(chǎn)生，為了提高陽性率，建議通過雙酶切進(jìn)行質(zhì)粒線性化?？寺〉漠a(chǎn)生，為了提高陽性率，建議通過雙酶切進(jìn)行質(zhì)粒線性化。2）PCR擴(kuò)增擴(kuò)增 選

14、取合適的位點(diǎn)，設(shè)計(jì)正向和反向引物，引物長度一般在選取合適的位點(diǎn)，設(shè)計(jì)正向和反向引物，引物長度一般在18-20bp左右，建左右，建議用高保真的聚合酶擴(kuò)增。為了避免模板質(zhì)粒議用高保真的聚合酶擴(kuò)增。為了避免模板質(zhì)粒DNA對(duì)后續(xù)試驗(yàn)的影響，建議對(duì)后續(xù)試驗(yàn)的影響，建議用用Dpn I內(nèi)切酶消化內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，降低背景，提高陽性率。產(chǎn)物，降低背景，提高陽性率。 不管采取哪種方法，最終線性化載體的濃度需不管采取哪種方法，最終線性化載體的濃度需50ng/ul，高濃度的載體有，高濃度的載體有利于提高效率。利于提高效率。 3. 線性載體的制備線性載體的制備4. 同源重組反應(yīng)同源重組反應(yīng)試劑試劑加量加量10 x

15、 Buffer1ulRecombination Enzyme1ul線性化載體（線性化載體（50ng/ul） 50-100ng插入片段（插入片段（50ng/ul）150-200ngdd H2O補(bǔ)足至補(bǔ)足至10ul（1）配置反應(yīng)體系）配置反應(yīng)體系 將目的將目的DNA片段和線性化載體以一定的摩爾比加到管子中進(jìn)行重組片段和線性化載體以一定的摩爾比加到管子中進(jìn)行重組反應(yīng)（摩爾比可計(jì)算方法見附錄），反應(yīng)（摩爾比可計(jì)算方法見附錄），10 ul體系體系(見下表見下表) 注意：注意：1.目的片段與載體的摩爾比在目的片段與載體的摩爾比在2: :1-5: :1之間，摩爾比低于之間，摩爾比低于2:1效效率會(huì)降低；率會(huì)

16、降低；2.反應(yīng)時(shí)間在反應(yīng)時(shí)間在15-30分鐘，時(shí)間太短不利于重組反應(yīng)分鐘，時(shí)間太短不利于重組反應(yīng)（2）短暫離心混勻，）短暫離心混勻，37孵育孵育15分鐘。分鐘。（3）反應(yīng)結(jié)束后，取）反應(yīng)結(jié)束后，取5-10ul反應(yīng)液立即進(jìn)行轉(zhuǎn)化，剩余反應(yīng)液可在反應(yīng)液立即進(jìn)行轉(zhuǎn)化，剩余反應(yīng)液可在4或或-20保存待用。保存待用。 5.重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞冰上融化一管100 l的DH5感受態(tài)細(xì)胞。加入5-10l反應(yīng)液到感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰上孵育30分鐘。42水浴中熱激45-90秒后，冰浴3分鐘。注意：所使用的感受態(tài)細(xì)胞效率1108cfu/g.加入890l SOC液體培養(yǎng)基，37復(fù)蘇4

17、5-60分鐘。6. 重組子篩選重組子篩選u 復(fù)蘇培養(yǎng)物8000rpm離心1分鐘收集菌體，根據(jù)需要將一定量的菌體均勻的涂布在含抗生素平板上,37倒置培養(yǎng)12-16h后觀察菌落生長情況。u 使用抗生素的最低抑菌濃度，有利于獲得更多的重組子：在10g/mL的卡那霉素平板上重組子的數(shù)目是60g/mL的卡那霉素平板上重組子的數(shù)目的6倍。 抗生素使用濃度與Red/ET重組效率的關(guān)系 常用抗生素的工作濃度常用抗生素的工作濃度7. 重組子的檢測重組子的檢測u 檢測方法：酶切分析、檢測方法：酶切分析、PCR檢測、平板雙劃線、測序等；檢測、平板雙劃線、測序等； 一般采用菌落PCR進(jìn)行陽性克隆鑒定。為避免假陽性結(jié)果

18、，鑒定引物選擇一條為載體特異性引物，另一條引物為目的片段特異性引物。u 高拷貝質(zhì)粒修飾存在高拷貝質(zhì)粒修飾存在“質(zhì)粒多聚體質(zhì)粒多聚體” 現(xiàn)象；現(xiàn)象；u “質(zhì)粒多聚體質(zhì)粒多聚體”問題解決辦法：問題解決辦法： 采用采用“線性線性DNA+線性線性DNA”重組方式；重組方式； 利用利用RecE/RecT重組酶系統(tǒng)；重組酶系統(tǒng)； 減低質(zhì)粒拷貝數(shù)減低質(zhì)?？截悢?shù)?？敲顾乜剐曰颍敲顾乜剐曰颍↘an）替換）替換pUC19中的氨芐抗性基因（中的氨芐抗性基因（Amp）“質(zhì)粒多聚體質(zhì)粒多聚體” 現(xiàn)象現(xiàn)象解決辦法：解決辦法：u 采用采用“線性線性DNA+線性線性DNA”重組方式；重組方式；u 利用利用RecE/

19、RecT重組酶系統(tǒng)；重組酶系統(tǒng)；u 減低質(zhì)?？截悢?shù)。減低質(zhì)?？截悢?shù)。六、六、 Red/ET重組技術(shù)的主要應(yīng)用重組技術(shù)的主要應(yīng)用1. 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 2. 染色體的修飾 3. 亞克隆（Subcloning） 4. 直接克?。―irect cloning）1. 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 (1) 傳統(tǒng)基因克隆技術(shù)的缺點(diǎn)傳統(tǒng)基因克隆技術(shù)的缺點(diǎn) 傳統(tǒng)克隆技術(shù)依賴限制性酶切位點(diǎn)和內(nèi)切 酶的消化，當(dāng)缺少合適的酶切位點(diǎn)或者某個(gè)酶切位點(diǎn)在目的片段中大量存在時(shí)，利用內(nèi)切酶消化難以得到相應(yīng)的產(chǎn)物。 方法看似簡單，但實(shí)驗(yàn)周期長。 大片段難以與載體正確連接。 無法同時(shí)連接多個(gè)（2個(gè)以上）的DNA片段。限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶連接

20、酶連接酶步驟步驟1 1：酶切目的片段酶切目的片段步驟步驟2 2：酶切載體：酶切載體步驟步驟3:3:目的片段與載體連接目的片段與載體連接同源重組克隆步驟同源重組克隆步驟傳統(tǒng)克隆步驟傳統(tǒng)克隆步驟步驟步驟4:4:重組子轉(zhuǎn)化到感重組子轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞受態(tài)細(xì)胞同源重組克隆同源重組克隆傳統(tǒng)克隆傳統(tǒng)克隆克隆片段長度50bp-10kb50bp-2kb一次克隆片段數(shù)1-5個(gè)1個(gè)感受態(tài)效率要求1108cfu/ug以上1107cfu/ug以上所用的酶重組酶T4連接酶片段的插入位點(diǎn)任何位點(diǎn)特定位點(diǎn)片段酶切不需要需要載體線性化方法酶切或PCR酶切同源重組克隆與傳統(tǒng)克隆比較插入選擇標(biāo)記插入選擇標(biāo)記插入無選擇標(biāo)記的插入無選擇標(biāo)記的DNA片段片段2. 染色體的修飾 E. coli染色體上插入抗性基因 傳統(tǒng)基因工程技術(shù)（A）和Red/ET