實(shí)驗(yàn)：酶切、膠回收和連接

1、限制性內(nèi)切核酸酶消化限制性內(nèi)切核酸酶消化DNA、從瓊脂、從瓊脂糖凝膠中回收糖凝膠中回收DNA及載體與目的基因及載體與目的基因的連接的連接 n掌握限制性內(nèi)切酶特異性切割DNA的原理與方法n掌握DNA片段從瓊脂糖凝膠中回收的原理與方法n掌握如何構(gòu)建體外重組DNA分子及DNA的連接方法 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?限制性內(nèi)切核酸酶消化限制性內(nèi)切核酸酶消化DNA n 限制性內(nèi)切核酸酶（restriction enzyme) 是一類識(shí)別DNA上特意核苷酸序列并產(chǎn)生切割反應(yīng)的內(nèi)切核酸酶(endonuclease)的總稱。在基因操作中，這些酶作為“剪刀”對(duì)DNA起剪切作用，是分子生物學(xué)研究中不可缺少的酶之一。n限制性

2、內(nèi)切酶能識(shí)別，結(jié)合雙鏈DNA分子中特異的核苷酸序列，并在該序列內(nèi)部水解核苷酸之間的3,5-磷酸二酯鍵，切斷DNA雙鏈結(jié)構(gòu)。n限制性內(nèi)切酶識(shí)別的DNA序列一般長(zhǎng)度為46個(gè)核苷酸，具有回文結(jié)構(gòu)（雙鏈DNA中含有的二個(gè)結(jié)構(gòu)相同、方向相反的序列稱為反向重復(fù)序列 ）特征。n限制性內(nèi)切核酸酶消化產(chǎn)生的DNA末段分為5粘性末端，平末端，3粘性末端三大類。末端的5端為磷酸基團(tuán)（-P)，3端為羥基基團(tuán)(-OH)。這些末端結(jié)構(gòu)可能影響其它酶（如連接酶）的反應(yīng)效率，應(yīng)特別注意。原原 理理n 在我們今天的實(shí)驗(yàn)中，用到兩種限制性酶分別是Hind和EcoR，這兩種酶切割后產(chǎn)生的片段都具有粘性末端，可以保證酶切產(chǎn)物與載體正

3、確的連接。酶切體系酶切體系n 10M : 2mln Hind : 1mln EcoR: 1mln ddH2O : 6mln 質(zhì) 粒 ： 10ml 總體積 : 20ml 將酶切體系按順序加好后放入已預(yù)熱的37C 的水浴鍋中，使反應(yīng)體系在這個(gè)溫度下進(jìn)行酶切。 酶切2h后加2ml 10loading buffer終止酶切反應(yīng)，取全部的樣品用于膠回收全部的樣品用于膠回收。試驗(yàn)中用到的兩種酶的緩沖液試驗(yàn)中用到的兩種酶的緩沖液nHind: EcoR: M Buffer H Buffer n 對(duì)于Hind來說，在含有 M Buffer 時(shí)的酶切效率最高；n而對(duì)于EcoR來說，在H Buffer里面的酶切效率

4、高；n但在兩者同時(shí)進(jìn)行酶切時(shí)，在M Buffer里時(shí)的效率最高。因此本實(shí)驗(yàn)中我們用M Buffer來進(jìn)行Hind和EcoR的雙酶切。從瓊脂糖凝膠中回收從瓊脂糖凝膠中回收DNAn在酶切的過程中，除產(chǎn)生我們所需要的目的片段外，還會(huì)產(chǎn)生一些小片段，這些小片段可能會(huì)與載體連接，從而產(chǎn)生干擾，去除這些小片段的最好的方法就是進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。瓊脂糖凝膠回收瓊脂糖凝膠回收：原理：n 不同分子量的DNA片段在瓊脂糖凝膠電泳中由于泳動(dòng)速度不一樣而分離，通過回收可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。n NaI存在條件下，加熱至55，含有DNA片段的瓊脂糖凝膠就會(huì)融化，然后可利用硅膠樹脂吸附DNA分子，從而得到純凈的DNA片段。n 硅

5、膠樹脂在高鹽離子濃度下可以高效專一的吸附DNA，通過離心可將DNA片段沉淀下來，在堿性低鹽濃度下其與DNA的結(jié)合能力會(huì)急劇降低，使用弱堿溶液如TE(pH8.0)等可以從硅膠離心柱洗脫得到純凈的DNA片段。1. 取一干凈的1.5ml的離心管，稱重，標(biāo)記。2. 紫外下用干凈的手術(shù)刀切下含有目的片段的DNA凝膠，放入已稱重的離心管中，稱重。3. 按每100mg瓊脂糖凝膠加入400ml binding solution的量添加solution至裝有凝膠的離心管中。5060放510min融膠。4. 將以上溶液轉(zhuǎn)移至Genclean柱中，室溫放置2min，6000rpm室溫離心1min。將離心下來的液體倒

6、回Genclean柱中再重復(fù)離心一次。棄收集管中的廢液。操作步驟操作步驟5. 往上述管中加入500ml wash solution，12000rpm，1min，棄廢液。6. 重復(fù)步驟5一次。7. 將Genclean柱放回收集管中，12000rpm ，1min，徹底去除wash solution。8. 將Genclean柱放到一干凈的1.5ml的離心管中，加入30ml Elution buffer,37 放置2min, 12000rpm,1min.所得液體即目的片段。9. 取5ml目的片段，加入1ml 6loading buffer，電泳鑒定。剩余液體可直接用于后續(xù)試驗(yàn)或-20 保存。注意事項(xiàng)注

7、意事項(xiàng)n電泳所用的膠的濃度為1%，膠經(jīng)凍融后，孔徑較大，利于擠壓。n溴化乙錠染色后的DNA易受紫外光破壞，故盡量放置于暗室，切帶時(shí)應(yīng)使用長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈，切膠時(shí)間盡量短。n在切膠時(shí)，要注意盡量沿目的片段的邊緣切下，使其所帶的瓊脂糖盡量少。這樣瓊脂糖不會(huì)影響后面的提純。DNA的重組連接的重組連接n原理： DNA重組連接是通過將已經(jīng)切開的載體和外源DNA，通過DNA連接酶催化兩雙鏈DNA片段組鄰的5端磷酸與3端羥基之間形成磷酸酯鍵，從而形成新的DNA。本實(shí)驗(yàn)利用T4DNA連接酶，有Mg2+,ATP存在的連接體系中，將載體pUC18與目的基因連接起來。連接體系連接體系n DNA ： 7mln 載 體 ： 1mln T4