神經(jīng)系統(tǒng)的信號傳遞與電生理學(xué)研究方法課件

1、神經(jīng)系統(tǒng)的信號傳遞與電生理學(xué)研究方法 一、神經(jīng)系統(tǒng)的信號傳遞 二、電生理學(xué)方法介紹一、神經(jīng)系統(tǒng)的信號傳遞1.電信號： 局部電位（localized graded potential）：感受器、突觸后膜、運動終板。 動作電位（action potential）：在神經(jīng)纖維上傳到的AP稱為神經(jīng)沖動。2. 化學(xué)性信息（化學(xué)性突觸傳遞） ：神經(jīng)遞質(zhì)，激素。1. 神經(jīng)元軸突內(nèi)神經(jīng)活動的電變化 在神經(jīng)機制探索中，唯一最重要的發(fā)現(xiàn)是神經(jīng)沖動與電位變化相一致。神經(jīng)活動的電信號給予研究者一個研究神經(jīng)系統(tǒng)功能的手段；電信號像一個失蹤物，通過它，研究者可在活體的復(fù)雜結(jié)構(gòu)中跟蹤神經(jīng)沖動的去向，同時，也是了解信息如何在

2、神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)編碼的唯一線索。Measuring the resting membrane potential1) 電信號Methods of Reconding Action Potentials1)電信號Flipping the membrane potential by changing the relative ionic permeability of the membrane.神經(jīng)纖維靜息電位與動作電位波形與產(chǎn)生機制The voltage-gated channelStructure of the voltage-gated sodium channela. The molecule

3、consists of four domains, I-IV.b. An expanded view of one domain showing the voltage sensor of alpha helix S4 and the pore loop (red).c. The molecule arrange of domains form a pore between them.2. 神經(jīng)元-神經(jīng)元間化學(xué)性突觸傳遞Synaptic arrangements in the CNSVarious sizes of CNS synapses 突觸神經(jīng)生理學(xué)是神經(jīng)科學(xué)重要分支。研究突觸電生理學(xué)、

4、結(jié)構(gòu)、功能和神經(jīng)化學(xué)。 人類神經(jīng)系統(tǒng)每個細(xì)胞處在不同的反復(fù)分支的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中。突觸種類和大小復(fù)雜的。2. 神經(jīng)元-神經(jīng)元間化學(xué)性突觸傳遞2. 神經(jīng)元-神經(jīng)元間化學(xué)性突觸傳遞A membrane ion channelThe properties: ion selectivity and gating.A membrane ion channelThe properties: ion selectivity and gating.Transmitter actions at G-protein-coupled receptors. The binding of neurotransmitter t

5、o the receptor leads to the activation of G-proteins. Activated G-proteins activate effector proteins, which may be (a) ion channels or (b) enzymes that generate intracellular second messengers. 神經(jīng)纖維上傳導(dǎo)的動作電位（all or non ，不衰減性傳導(dǎo)）：分析其頻率、潛伏期、傳導(dǎo)速度； 神經(jīng)元胞體及樹突產(chǎn)生的局部電位（幅度總和）：感受器，突觸后膜EPSP、IPSP，運動終板； 神經(jīng)遞質(zhì)和受體。 電

6、壓和化學(xué)門控通道：理、化性質(zhì)?？偨Y(jié)：電生理學(xué)研究的指標(biāo)二、電生理學(xué)方法細(xì)胞外紀(jì)錄 (extracellular recording): 細(xì)胞內(nèi)紀(jì)錄 (intracellular single unit recording)：電壓鉗（voltage clamp）膜片鉗（patch clamp） 腦電圖 (EEG)誘發(fā)電位（evoked potential） 微電泳（microelectrophoresis） 抗體微量注射 正電子發(fā)射斷層掃描術(shù)磁共振成像術(shù)（1) 陰極射線示波器（oscillograph）：顯示電信號，電子流惰性小，是記錄神經(jīng)非常短促和微弱電流最好的方法。（2）生物電放大器(amp

7、lifier): 頻率相應(yīng)范圍大（通頻帶從0100kHz），有足夠高的放大能力，低噪聲，高輸入阻抗，高的辨差比。（3）電子刺激器（electronic stimulator）: 矩形脈沖：刺激強度（幅度: 最大瞬時值，0.001200V之間，連續(xù)可調(diào)）、時間（波寬：10s1s）、頻率(波寬和延遲時間之和小于頻率的倒數(shù))、延遲 ；刺激方式：單，連續(xù)，雙脈沖刺激；同步輸出：觸發(fā)其他需要與刺激同步的儀器（示波器，微電泳，照相等）一起工作。刺激隔離器（insulator）。（4） 儲存和分析電生理實驗結(jié)果的儀器：示波器照相機、錄音機、計算機（疊加，直方圖，平均等)。常用的主要儀器 電記錄的技術(shù)(A)

8、細(xì)胞外記錄法記錄法記錄單個細(xì)胞或一群細(xì)胞的電活動。(B) 微電極細(xì)胞內(nèi)記錄法記錄膜內(nèi)外的電位差：靜息電位和動作電位。(C) 全細(xì)胞膜片鉗記錄法記錄當(dāng)膜上單個通道開啟或關(guān)閉時的電流。工作原理：把引導(dǎo)電極安放在神經(jīng)組織的表面或附近引導(dǎo)神經(jīng)組織的電活動?；顒硬课坏纳窠?jīng)元去極化，未活動部位極化狀態(tài)，在容積導(dǎo)體中兩部位電位不同，電流流動，放置在細(xì)胞表面的電極會紀(jì)錄出兩者間的電位差。優(yōu)點：方便，電極不插入細(xì)胞。特點：細(xì)胞外電位的波形因記錄細(xì)胞的不同部位而異神經(jīng)纖維外紀(jì)錄： 細(xì)胞外紀(jì)錄 Extracellular Recording CNS神經(jīng)元細(xì)胞外記錄：在接受其他神經(jīng)元傳來的興奮性或抑制性的信息被激活后

9、，可再所記錄神經(jīng)元的被激活部位（電穴）和該神經(jīng)元的其他部位（電源）間形成局部電流。玻璃微電極: 尖端直：0.5m; 電極電組：520M; 充灌液：3mol/L KCI, 4mol/L NaCI, 2%旁胺天藍(lán)，0.5mol/L醋酸鈉溶液pH7.7;）。鎢絲金屬微電極：尖端4070m, 電阻低，機械強度高，直接穿透硬腦膜，電噪聲低，可反復(fù)使用；細(xì)胞外紀(jì)錄 Extracellular Recording 根據(jù)細(xì)胞外記錄微電極處于電源或電穴的位置關(guān)系，能記錄一個極性不同的電位（正或負(fù)）。胞外電極記錄的電位大小和波形會有多種變化。因此，重點分析放電頻率和潛伏期，而不去比較放電的幅度。工作原理：在膜兩側(cè)

10、各置一個電極形成一個回路，記錄膜電位（membrane potential）： EPSP, IPSP，動作電位。優(yōu)點: 準(zhǔn)確測量膜電位的絕對值， 因膜內(nèi)到膜外電阻很大, 值可高達100mV。意義：是研究神經(jīng)元基本生物物理特性的有效手段。關(guān)鍵問題（成功而持久的胞內(nèi)記錄）：1）穩(wěn)定：排除機械和動物呼吸和循環(huán)功能引起的運動；2）合格的玻璃微電極。細(xì)胞內(nèi)紀(jì)錄 Intracellular Single Unit Recording(Hodgkin and Huxley)細(xì)胞內(nèi)紀(jì)錄 Intracellular Single Unit Recording 由于插入神經(jīng)元內(nèi)胞體并記錄細(xì)胞內(nèi)電位的微電極技術(shù)的發(fā)

11、展，Eccles等首先將微電極插入脊髓運動神經(jīng)元的胞體，記錄哺乳類動物脊髓的大運動神經(jīng)元胞內(nèi)電位。運動神經(jīng)元的胞體直徑70m;微電極尖端直徑0.5 m；跨膜電位差6080mV。圖7.3：用微電極在貓脊髓運動神經(jīng)元內(nèi)記錄的突觸后電位A.B.C:三種不同的閾下刺激(40秒掃描的疊加)； D:10次刺激引起的峰電位。圖7.12：刺激神經(jīng)在單根肌纖維的終板上所誘發(fā)的電位a. 正常終板電位和相繼發(fā)生的肌肉峰電位；b,c,d,e: 箭毒進行性地阻滯肌反應(yīng); e只留下終板電位，神經(jīng)肌肉傳遞被箭毒阻滯了。圖7.2：槍烏賊星狀神經(jīng)節(jié)的突觸前纖維表現(xiàn)的動作電位和在突觸后神經(jīng)元誘發(fā)的局部電位。 20世紀(jì)50年代，H

12、odgkin and Huxley 首次應(yīng)用電壓鉗技術(shù)對槍烏賊的標(biāo)本進行膜電流的測定。工作原理：離子流過通道所形成的離子流是形成動作電位的基礎(chǔ)。電生理實驗以電流作為刺激源，使可興奮細(xì)胞產(chǎn)生興奮，然后測定其膜電壓以確定離子通道的狀態(tài)。但在形成動作電位時所產(chǎn)生的離子流可影響膜電位，而膜電位的變化又會影響該離子的通透性的變化。因而，須人為地使膜電位在一定時間內(nèi)維持在一個固定水平。電壓鉗技術(shù)是通過插入細(xì)胞內(nèi)的一根微電極人為向胞內(nèi)補充電流，補充的電流正好等于跨膜流出的反相離子電流（大小相等方向相反）。意義 ：1）確保膜通透性發(fā)生改變時，控制膜電位始終維持在指令電位的水平（不變）；2）通過電流檢測裝置，記

13、錄到補充入胞內(nèi)的注入電流，它相當(dāng)于離子電流的反相電流。這樣可測定在不同膜電位水平的離子電流，從而了解膜通道的電導(dǎo)及功能活動。電壓鉗 voltage clamp應(yīng)用：定量分析刺激與細(xì)胞后膜電導(dǎo)的變化。反映整個細(xì)胞膜上所有通道活動的綜合結(jié)果。不足：此項技術(shù)不能了解單個離子通道的功能活動狀態(tài)。另外，牽制的面積大，包含大量的隨機開放和關(guān)閉的通道，形成的背景噪音也大，掩蓋單一通道的微弱電流，另外，小神經(jīng)元插入兩個電極不容易。電壓鉗裝置圖和電壓鉗實驗記錄的膜電流 1976年由德國Neher 和Sakmann 發(fā)明（1991 Nobel Prize）。工作原理：同電壓鉗，即在人為設(shè)置電壓并固定的情況下記錄分

14、析離子通道。膜片鉗技術(shù)使用玻璃微電極吸管把只含1-3個離子通道、面積為幾個mm2的細(xì)胞膜通過負(fù)壓吸引封接起來。由于電極尖端與細(xì)胞膜的高阻封接，在電極尖端下的那片膜與膜的其他部分從電學(xué)上隔離。因此，片膜內(nèi)通道開放所產(chǎn)生的電流流進玻璃吸管，用一個極為敏感的膜片鉗放大器測量此電流強度，即代表單一離子通道電流。性能：電極尖端(15m)與膜之間電阻10 9 （ G, 10G100G）的高封接（giga-seals）, 大大提高了膜片鉗的可靠性和靈敏性，可測量0.06pA的電流，1m的空間分辨力和10s時間的分辨力。意義：膜上電壓依賴型離子通道有開與關(guān)兩種電導(dǎo)狀態(tài)。通道膜片鉗技術(shù)可直接觀察離子通道“開啟”

15、和“關(guān)閉”。膜片鉗 Patch ClampPatch clamping record ionic currents through single channels The patch contains a voltage-gated Na+ channel, Changing the membrane potential from 65 mV to 40 mV,Cause the channel to open,and current (I) will flow through it (e).The amplitude of the measured current at a constant

16、 membrane voltage reflects the channel conductance, and the duration of the current reflects the time the channel is open. a. A glass electrode onto the membrane of the neuronB. Applying suction through the electrode tip.c. Withdraw the electrode from the cell, the membrane patch was torn away.D. Io

17、nic currents was measured as steady voltages across the membrane.The opening and closing of Na+ channels upon membrane depolarization(a): The electrical potential across a patch of membrane. When the membrane potential is changed from 65-40mV, the Na+ channels pop open.(b): Three different channels

18、respond to the voltage step.(C) A model for how changes in the conformation of the Na+ channel protein might yield its functional properies.The shortcut pathway.（a）G-proteins in heart muscle are activated by ACh binding to muscanrinic receptors.(b) The activated G subunit directly gates a K+ channel

19、.A patch-clamp recording from a transmitter-gated ion channel. Ionic current passes through the channels when the channels are open in the presence of neurotransmitter. 1924年德國Jena, Hans Berger第一次紀(jì)錄人類腦電圖（腦電流描記術(shù)的大部分基礎(chǔ)知識和腦電圖的用途：生理、神經(jīng)、精神和心理 ）。 雙極或單極引導(dǎo)法: 將引導(dǎo)電極放在顱骨表面之上，記錄腦活動時微弱電流，通過強力放大記錄出來的電位成為腦電圖（EEG）。

20、單極引導(dǎo)可更好地確定電信號的發(fā)源地，有利于臨床病灶診斷定位。反映皮層錐體細(xì)胞的總和電位活動。錐體細(xì)胞的尖端樹突相互平行，產(chǎn)生細(xì)胞外電流的總和。正常腦電圖： ，兩種節(jié)律。腦電圖 Electroencephalogram圖：正常成年人的典型腦電圖注意節(jié)律在頭的后部占優(yōu)勢The generation of large EEG signals by synchronous activity. (a) In a population of pyramidal cells under an EEG electrod, each neuron receives many synaptic inputs. (

21、b) If the inputs fire at irregular intervals, the pyramidal cell responses are not synchronized, and the summed activity detected by the electrode has small amplitude. (c) If the same number of inputs fire within a narrow window so that the pyramidal cell responses are synchronized, the resulting EE

22、G sum is much larger.影響腦電圖的因素：1. 神經(jīng)細(xì)胞代謝（缺氧、低血糖和酒精）：腦電圖出現(xiàn)慢節(jié)律，電壓降低。2. 藥物：抗痙攣藥，麻醉藥：乙醚，巴比妥鹽。EEG與知覺水平相關(guān)；3. 睡眠：EEG變化非常復(fù)雜。 發(fā)現(xiàn)：誘發(fā)電位電生理學(xué)始于1913 prevdish-Neminsky 的實驗。（電刺激坐骨神經(jīng)，皮層腦電圖上出現(xiàn)明顯的電波偏移。一種分布非常廣泛的活動，是追蹤外周沖動到達皮層通路的一種工具。 定義：中樞神經(jīng)系統(tǒng)任何部位對于感受器官、感受神經(jīng)、感覺通路上的任何一點受刺激時所產(chǎn)生的電變化。 性質(zhì)：慢電位變化，主要是突觸后電位總和而成。波幅一般在0.120V之間。由于波

23、幅小，多在自發(fā)放電的背景上產(chǎn)生誘發(fā)電位。 平均誘發(fā)電位（AEP）：誘發(fā)電位出現(xiàn)與施加的刺激有一定時間關(guān)系。相同實驗條件下，同一系統(tǒng)，潛伏期的長短是恒定的。用計算機平均疊加技術(shù)把多次反應(yīng)的微弱電信號疊加起來，使其從背景電波中清晰地記錄。 臨床應(yīng)用：聽覺誘發(fā)電位，視覺誘發(fā)電位，軀體感覺誘發(fā)電位.誘發(fā)電位 Evoked Potential軀體感覺誘發(fā)電位:在軀體感覺系統(tǒng)中，從楔核、丘腦和皮層可記錄到刺激外周神經(jīng)引起的反應(yīng)。刺激右側(cè)上肢皮膚在左側(cè)中央后回紀(jì)錄的誘發(fā)電位a. 感受器電位；b.雙極細(xì)胞；C. 色素細(xì)胞圖10.7 “注意”時皮層反應(yīng)的變化 不論受試者是否“注意”短聲或警惕短聲即將來臨，耳蝸神

24、經(jīng)反應(yīng)無顯著變化，而皮層反應(yīng)出現(xiàn)明顯的CNV.微音器電位：多個毛細(xì)胞感受器電位的總和。A與B對比說明，聲音位相改變時，微音器電位位相倒轉(zhuǎn)，而聽神經(jīng)復(fù)合動作電位位相不變。 應(yīng)用光學(xué)記錄技術(shù)，把特別研制的熒光染料與細(xì)胞膜結(jié)合，在有動作電位發(fā)生時，這種燃料的光吸收特性發(fā)生改變。 正電子發(fā)射斷層掃描術(shù)（positron emission tomography, PET） 磁共振成像術(shù)（magnetic resonace imaging） 顯示清醒人的大腦中受刺激區(qū)域，或發(fā)動運動時的活動狀態(tài)。神經(jīng)元活動的無創(chuàng)傷技術(shù)正電子發(fā)射斷層掃描術(shù)Positron Emission Tomography, PETA.

25、看一個詞B. 聽一個詞C. 說一個詞D. 想一個詞利用正電子湮滅反應(yīng)的物理學(xué)特性，以及腦激活時腦的能量代謝加強，血流量增加及血液容積改變等生物學(xué)特性，總和而成的最先進的腦功能檢側(cè)技術(shù)。PET掃描首先將能發(fā)射正電子的放射性核素（18F 或15O）標(biāo)記到選定的化合物上，然后將它引入體內(nèi)。放射性核素在衰變過程中發(fā)射出正電子，與鄰近組織中的電子相遇后湮滅，探測器確定其位置。 腦功能性磁共振成像術(shù) Magnetic Resonace Imaging功能性磁共振成像技術(shù)檢測視皮層的功能活動A 未刺激時組織的去氧血紅蛋白比例高；B. 刺激后組織氧合血紅蛋白增高；C. 視覺刺激后腦影像視皮層活動區(qū)。突觸前神經(jīng)

26、末梢的遞質(zhì)以量子式釋放的，量很微少。因此在進行神經(jīng)遞質(zhì)功能測定時，只能用最小而有效的劑量模擬神經(jīng)遞質(zhì)的生理功能。這是與藥理學(xué)方法明顯的區(qū)別。藥理學(xué)研究可能用很大的劑量，所引起的效應(yīng)可能與生理效應(yīng)不同甚至相反。 微電泳（microelectrophoresis） 抗體微量注射 神經(jīng)遞質(zhì)的功能測定 定義：借助微電極通以一定的電流將解離物質(zhì)電泳到神經(jīng)元附近，觀察神經(jīng)遞質(zhì)或其他藥物對該神經(jīng)元的作用。 基本原理：外加電流通過含解離物質(zhì)溶液的微電極時，會將微電極內(nèi)的解離物質(zhì)從管尖釋放出來。例如在微電極接正極，動物頭皮接負(fù)極時，帶陽離子的物質(zhì)從微電極中釋出。相反，微電極接負(fù)極，頭皮接正極（內(nèi)向電流）時，微電極釋出的是帶負(fù)離子的物質(zhì)。微電泳時解離物質(zhì)從微電極釋出量，與它通過的電荷量成正比。因此，通常用微電極的電流強度表示解離物質(zhì)的釋放量。（3）方法：1）拉制微電極：五管：每管尖端直徑1-3m, 五管總直徑510m.其中，一管為紀(jì)錄，一管為對照，三管為藥物。2）微電極充滿溶液后，在立體定位以幫助下，姜微電極插至所需要觀察的腦核團內(nèi)的神經(jīng)元附近。微電泳儀上的輸出接頭通過Ag-AgCI細(xì)絲插入微電極各管中，另一共用接頭連在動物頭