腺病毒的制備by王晶晶

1、腺病毒的制備簡(jiǎn)介：腺病毒（adenovirus）是一種無(wú)包膜的線狀雙鏈 DNA病毒，基因組長(zhǎng)約 36kb?；蚪M上分布 著4個(gè)早期轉(zhuǎn)錄子（E1、E2、E3、E4）承擔(dān)調(diào)節(jié)功能，以及一個(gè)晚期轉(zhuǎn)錄子負(fù)責(zé)結(jié)構(gòu)蛋白的 編碼。其中，E1的缺失可造成病毒在復(fù)制階段的流產(chǎn)，重組腺病毒必須在293細(xì)胞等表達(dá)E1蛋白的細(xì)胞系中包裝；E3為復(fù)制非必須區(qū)，影響病毒的免疫逃逸，其缺失則可以大大地 擴(kuò)大插入容量。腺病毒在自然界分布廣泛，至少存在 100種以上的血清型。目前的腺病毒載體大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）為基礎(chǔ)。腺病毒載體轉(zhuǎn)基因效率高，體外實(shí)驗(yàn)通常接近100%的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；可轉(zhuǎn)導(dǎo)不同類(lèi)型的人組織細(xì)胞，不受靶

2、細(xì)胞是否為分裂細(xì)胞所限，甚至包括來(lái)自高度分化的組織中的細(xì)胞，例如骨骼肌細(xì)胞，肺細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞和心臟細(xì)胞；容易制得高滴度病毒載體；進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并不整合到除卵細(xì)胞外的宿主細(xì)胞基因組中，僅瞬間表達(dá)，安全性高。腺病毒載體已成為繼逆轉(zhuǎn)錄病毒載體之后廣泛應(yīng)用且最具前景的病毒載體?；靖拍睿篟CA在擴(kuò)增或制備復(fù)制缺陷型腺病毒時(shí)會(huì)產(chǎn)生復(fù)制型 腺病毒（replication competent adenoviruses, RCA）, RCA是因?yàn)橹亟M腺病毒的基因組與293基因組的E1同源序列間發(fā)生重組而產(chǎn)生的。這就導(dǎo)致目的基因丟失而被E1區(qū)代替。具體表現(xiàn)是在本不支持病毒載體復(fù)制的細(xì)胞株（如 A549細(xì)胞）上產(chǎn)生病

3、毒的復(fù)制和擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)證明，復(fù)制型腺病毒（RCA）數(shù)量隨著腺病毒載體在293細(xì)胞上的傳代次數(shù)的增加而增加。RCA在其宿主細(xì)胞中可以自主復(fù)制 和擴(kuò)增，因此 RCA的產(chǎn)生會(huì)嚴(yán)重干擾重組腺病毒載體的使用效果和帶來(lái)安全隱患。要避免 RCA出現(xiàn)，以下兩點(diǎn)非常必要： 1）對(duì)原始毒種進(jìn)行13輪空斑純化； 2）盡量減少腺病毒在 293細(xì)胞上的傳代次數(shù)，建議建立至少兩級(jí)病毒種子庫(kù)。（尤為重要：一旦毒種中發(fā)現(xiàn)了 RCA建議重新重組出毒。）各種常用病毒單位的含義：VP：病毒顆粒（viral particle）,是活（有感染性）和 死”（無(wú)感染性）的腺病毒顆粒的總量。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，它代表了進(jìn)入肌體可能引起宿主針對(duì)腺病毒

4、的免疫反應(yīng)的腺病毒顆粒 總量。測(cè)定方法是 OD260法，只有經(jīng)過(guò)純化的腺病毒才能通過(guò)此方法測(cè)定VP/ml值。PFU:空斑形成單位（plaque formation unit ）,是有感染性的活”的腺病毒的總量，即腺病毒得活性單位。測(cè)定方法是將腺病毒樣品經(jīng)過(guò)一系列梯度稀釋后，感染293細(xì)胞并培養(yǎng)，通過(guò)計(jì)算細(xì)胞病變空斑數(shù)得到腺病毒樣品中PFU/ml值。IU:感染單位（infectious unit ）,和PFU一樣，是另一種腺病毒活性單位。測(cè)定方法是TCID50法。VP/PFU或VP/IU的值是判斷腺病毒純品中活病毒所占比例的重要依據(jù)。如果該病毒產(chǎn)品要 用于人體實(shí)驗(yàn)，按中國(guó)生物制品質(zhì)量要求，該比值

5、應(yīng)該在 33以下。用于普通實(shí)驗(yàn)研究，該 比值要求可以適當(dāng)放寬。操作細(xì)節(jié)：腺病毒的保存：避免反復(fù)凍融，分裝后液氮速凍，于 -70 C保存，建議不要在-20 C下長(zhǎng)期保存。腺病毒解 凍后最好保持在冰浴中， 并盡快使用。如果解凍后的病毒一時(shí)用不完，滴度足夠高時(shí)（比如101112VP/ml） , 4c可保存12周。另外，保存病毒的緩沖液保持在pH8.0對(duì)維持滴度非常重要。腺病毒載體在體外實(shí)驗(yàn)（in vitro）中應(yīng)注意的問(wèn)題：1）由于細(xì)胞表面受體的差異，腺病毒載體在不同的細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)效率不同?？筛鶕?jù)文獻(xiàn)報(bào)道或用帶報(bào)告基因的腺病毒載體判斷病毒用量。2）在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)感染病毒效果較好。避免在消化細(xì)胞

6、后立刻感染病毒，因?yàn)榇?時(shí)細(xì)胞膜上的病毒受體往往受到了暫時(shí)的破壞。培養(yǎng)過(guò)夜后再感染病毒，效果較好。3）選擇適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)導(dǎo) MOI （病毒感染單位數(shù)/細(xì)胞數(shù)），可以在MOI為0.11000范圍內(nèi)進(jìn)行 試驗(yàn)（10倍比稀釋?zhuān)?）感染病毒時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液的體積盡量小一些，以完全覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)。 如24孔板可用200ul,6孔板1ml。5）感染時(shí)間為90-120分鐘，即感染實(shí)驗(yàn)時(shí)，用盡量少的培養(yǎng)液覆蓋細(xì)胞，接毒后 2小時(shí)再 補(bǔ)充足夠的培養(yǎng)基。（可選：每15分鐘輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)液一次，以混勻。）6）選擇適當(dāng)表達(dá)檢測(cè)時(shí)間，一般感染病毒24h后就能檢測(cè)到目的基因的表達(dá)，48小時(shí)表達(dá)達(dá)到較高水平。卜面按AdEasyTM腺病

7、毒載體表達(dá)系統(tǒng)簡(jiǎn)述腺病毒的構(gòu)建與制備流程:Cloning Geneof InterestAmplify recombinant DNA, Digest with Pac IHomologous Recombination in vivo in BacteriaLinearizedRecombinant AdPlasmidVirus Production in AD-293 CellsFigure 1 Production of recombmanT adenovirus using rhe AdEosy XL adenoviral vecror systemAdEosy XL Adenovir

8、al Vector System.將基因克隆入穿梭載體（ shuttle ）。（其中，pShuttle不含有啟動(dòng)子和polyA ,pShuttle-CMV含有 CMV 啟動(dòng)子和 polyA ）載體，載體內(nèi)有兩套啟動(dòng)子和polyA ,可根據(jù)GFP的表另外，還有 pAdTrack-CMV達(dá)跟蹤目的基因的表達(dá)情況。Bm 6307GFPPAonPad 629LITPP.ipAdTrack-CMV9220 bpCMVfcoRY 2350Cbal 2356indlll 2362Khol 2368Od 2376 all 2383 pn I 2390 11112398RI 5285kPmel 527d. Pm

9、eI酶切構(gòu)建好的shuttle質(zhì)粒，電泳鑒定回收線性化的質(zhì)粒。.線性化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BJ5183-AD-1感受態(tài)細(xì)胞（預(yù)先轉(zhuǎn)化入了 pAdEasy-1 基因組DNA）, Kan抗性的LB平板上籃白斑篩選。.挑選直徑偏小的白色菌落，搖菌過(guò)夜，小量純化大質(zhì)粒（不能用普通試劑盒）。.取1/51/2 體積小量純化后的質(zhì)粒用 PacI酶切檢測(cè)，用重組前的 shuttle 質(zhì)粒作酶 切對(duì)照。0.8%的瓊脂糖凝膠電泳。（如下圖所示，4為重組前的 shuttle 質(zhì)粒，5為pAdEasy-1 基因組DNA , 6為重組后的質(zhì)粒。重組后的質(zhì)粒經(jīng)PacI酶切后，通常得到約30kb 大片段和 3.0kb 或4.5kb

10、 的小片段）1 *.將鑒定為重組陽(yáng)性的質(zhì)粒陽(yáng)轉(zhuǎn)入DH5 ”感受態(tài)。大量提取。. PacI酶切后，酚-氯仿抽提，乙醇沉淀回收，脫鹽，無(wú)菌去離子水溶解。.按照5ug線性化質(zhì)粒/35mm dish的比例用jetPEI轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞。.培養(yǎng)714天，35mm dish中的轉(zhuǎn)染后細(xì)胞出現(xiàn) CPE效應(yīng)（細(xì)胞變圓飄起，細(xì)胞核區(qū)明顯膨大）。收取原代病毒（1078pfu/ml ）：舊培養(yǎng)基重懸所有細(xì)胞，液氮/37oC反復(fù)凍融4-7次。12 , 000rpm 收上清。分裝后凍存于 -80 C。.擴(kuò)增病毒：向5X10 6個(gè)293A 細(xì)胞（100mm 培養(yǎng)皿，60% 匯度）中加入 0.5ml 原代病毒保存液

11、，加入培養(yǎng)基至1ml ,混勻。37 C CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)。補(bǔ)加入9ml DMEM5% 。再培養(yǎng)4872 小時(shí)，至半數(shù)左右細(xì)胞出現(xiàn)CPE。收集細(xì)胞，600 Xg離心35分鐘沉淀細(xì)胞，去上清后加入最小體積（一般為原始體積的1/10即1ml ）緩沖液（病毒保存溶液）重懸細(xì)胞。液氮 /37 C凍融4-7次，12 , 000rpm 離心去除細(xì)胞 碎片，收集上清。進(jìn)行下一輪感染擴(kuò)增。.培養(yǎng)3X10 810 9個(gè)細(xì)胞，接毒后48-72小時(shí)收裂解上清。在用氯化葩梯度離心純化。.氯化葩梯度離心法純化病毒：配好的CsCl/TE 溶液（D=1.43 ）加至sw32Ti離心管中 沿著管壁從同一點(diǎn)往下填入病毒清液（不成滴，保證勻速成線） Sw32Ti 25 , 600rpm（112 , 700g ） 4C 2hr超凈臺(tái)中小心將分層后的上層（培養(yǎng)基/PBS ）吸走分層后的界面上有白色細(xì)條帶（病毒帶），取出（2-3ml ）生理鹽水中4C透析過(guò)夜（500ml 0.9% NaCl/ 次X 3次） 加入2x凍存buffer分裝后液氮速凍，凍存于-80 C 備注：sw32Ti離心管有38.5ml和10ml兩種，用細(xì)管便于吸??；離心管洗凈后115 C高壓滅菌30分鐘溶液配制：CsCl溶液密度D與溶3中CsCl的重量百分比濃度 P之間的關(guān)系：D=138.11/137.48-Pe.g.配制 D=1.43 的 Cs