分光光度法血糖實(shí)習(xí)

1、 p31實(shí)驗(yàn)四 分光光度技術(shù)與 葡萄糖氧化酶法測定血糖第一頁，共二十四頁。一、分光光度法 分光光度法是根據(jù)不同物質(zhì)對(duì)于不同波長的光波具有選擇性吸收的光學(xué)特性，建立起來的分析方法。一分光光度法的依據(jù)第二頁，共二十四頁。I0It溶液 當(dāng)一定波長的光線通過某種透明介質(zhì)時(shí)，其中一局部光可透過，一局部光被吸收，這種某種溶液對(duì)一定波長的光的吸收特性可用于該物質(zhì)的定性和定量分析。第三頁，共二十四頁。分光光度計(jì)可獲得單色光 分光光度計(jì)利用棱鏡或光柵取得波長范圍為幾個(gè)nm甚至更窄的單色光。第四頁，共二十四頁。測定的時(shí)候需選擇不同物質(zhì)最大吸收峰所對(duì)應(yīng)的波長波長nm 光吸收值最大吸收峰第五頁，共二十四頁。分光光度計(jì)

2、的優(yōu)點(diǎn) 分光光度法的靈敏度、準(zhǔn)確度及選擇性都很高，是一種最常用的靈敏、精確、快速和簡便的分析方法。第六頁，共二十四頁。不同分光光度計(jì)的波長范圍紫外光(200-400nm)可見光(400-760nm)紅外光(760nm-30m)第七頁，共二十四頁。二分光光度法原理 Lambert-beer定律，該定律說明了溶液對(duì)單色光吸收的多少與溶液濃度及液層厚度的乘積成正比關(guān)系。I0Itlg=KCL第八頁，共二十四頁。I0Itlg：光密度O.D.，或稱吸光度AI0：入射光強(qiáng)度It：透過光強(qiáng)度K：吸光系數(shù)，它與該物質(zhì)吸收光能力有關(guān)I0Itlg=KCLC：溶液濃度(mol/L)L：液層厚度(cm)第九頁，共二十四

3、頁。三分光光度法計(jì)算待測溶液濃度的方法1、利用標(biāo)準(zhǔn)溶液測定溶液的濃度A標(biāo)= KC標(biāo)LA樣= KC樣LA標(biāo)A樣C標(biāo)C樣第十頁，共二十四頁。2、利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求得待測溶液的濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作： 先配制一系列能看出不同濃度的測定物標(biāo)準(zhǔn)溶液，按測定管顯色，分別讀取各管光密度，以各管光密度為縱坐標(biāo)，各管濃度為橫坐標(biāo)，作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。第十一頁，共二十四頁。濃度吸光度以測定管的光密度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可求得測定物濃度第十二頁，共二十四頁。四分光光度計(jì)的根本結(jié)構(gòu)1、光源2、單色光器3、吸收杯比色杯4、檢流計(jì)測光系統(tǒng)第十三頁，共二十四頁。752型分光光度計(jì)1A/T/C/F切換鍵2SD鍵具2個(gè)功能。傳輸數(shù)據(jù)；確認(rèn)當(dāng)前的F

4、值。3/0%調(diào)T為000.0。4)/100%調(diào)T 為100.0。轉(zhuǎn)換至A時(shí)，按鍵后顯示0.000。第十四頁，共二十四頁。五操作規(guī)程1.插上電源，翻開電源開關(guān)預(yù)熱30min。2.將波長旋鈕旋至所需波長。3.將樣品倒入比色皿放入比色皿架，空白管進(jìn)入光路，按A/T/C/F鍵至光標(biāo)于T位，開蓋按/0%鍵使讀數(shù)顯示000.0。關(guān)蓋，再按/100%鍵使讀數(shù)顯示100.0。按A/T/C/F鍵至光標(biāo)于A位，再按/100%顯示0.000。拉出樣品管進(jìn)入光路讀A。4.測定結(jié)束翻開樣品室蓋。5.取出比色皿清洗干凈后用蒸餾水沖洗并倒扣在粗濾紙上晾干。 第十五頁，共二十四頁。實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私馄咸烟茄趸阜y定血糖的根本原理

5、。掌握酶法測定血糖的實(shí)驗(yàn)方法熟悉分光光度計(jì)的使用。 P57二、葡萄糖氧化酶法測定血糖第十六頁，共二十四頁。實(shí)驗(yàn)原理：葡萄糖O2+H2O GOD 葡萄糖酸內(nèi)酯2O222O2 + 4-氨基安替比林+酚 POD 紅色醌類化合物 + 2O +O2 用分光光度法將待測溶液與同樣處理的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液比色，求待測血糖濃度。第十七頁，共二十四頁。儀器和藥品：血清、血糖試劑盒752可見紫外分光光度計(jì)。 第十八頁，共二十四頁。根本操作取三支試管，編號(hào)，下表加樣計(jì)算血糖濃度 編號(hào)試劑ml空白管標(biāo)準(zhǔn)管測定管血清0.02葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(100mg/dl)0.02酚試劑1.51.51.5酶試劑1,51.51.5混勻后37度保

6、溫15分鐘,在505nm波長處比色，顯色后2小時(shí)穩(wěn)定。第十九頁，共二十四頁。吸量管的使用拿吸量管正確姿勢取液姿勢卸放姿勢第二十頁，共二十四頁。微量取樣器的操作調(diào)至所需體積值；吸：垂直持取樣器用大拇指按至第一檔；將吸頭插入溶液松開大拇指，液面上升； 放：移出液面，按至第一檔繼續(xù)按至第二檔以排空液體。注意：移取另一樣品時(shí)， 更換新吸頭。第二十一頁，共二十四頁。計(jì)算公式測定管吸光度值標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值葡萄糖含量(mg/dL)=100參考數(shù)據(jù)： A測=0.217，A標(biāo)=0.258， 葡萄糖含量=84mg/dl 第二十二頁，共二十四頁。思考題試分析影響本試驗(yàn)的因素有哪些？操作分光光度計(jì)時(shí)要注意哪些關(guān)鍵點(diǎn)？第二十三頁，共二十四頁。內(nèi)容總結(jié)p31實(shí)驗(yàn)四 分光光度技術(shù)與。分光光度法是根據(jù)不同物質(zhì)對(duì)于不同。波長的光波具有選擇性吸收的光學(xué)特性，建立起來的分析方法。都很高，是一種最常用的靈敏、精確、。Lambert-beer定律，該定律說明了溶液對(duì)單色光吸收的多