GDNF在慢性收縮性損傷大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)中的蛋白表達(dá)

1、GDNF在慢性收縮性損傷大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)中的蛋白表達(dá)【摘要】目的討論膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)在慢性收縮性損傷(I)所致神經(jīng)病理性疼痛大鼠的L4背根神經(jīng)節(jié)中的蛋白表達(dá)。方法實(shí)驗(yàn)1：24只SD大鼠，隨機(jī)分為正常組(Naive組)、假手術(shù)組(Sha組)和I組(每組n=8)。Naive組不做任何手術(shù);Sha組僅暴露坐骨神經(jīng);I組按Bennett法結(jié)扎右側(cè)坐骨神經(jīng)主干制備I模型。分別測定Sha組和I組術(shù)前2天(根底值)及術(shù)后第1、3、5、7、14、21天(Naive組那么在相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn))大鼠同側(cè)(本實(shí)驗(yàn)為右側(cè))后足機(jī)械縮足反射閾值(T)和熱縮足反射埋伏期(PL)。實(shí)驗(yàn)2：18只SD大鼠隨

2、機(jī)分為正常組(Naive組)、假手術(shù)組(Sha組)和I組(每組n=6)。I組制備I模型，術(shù)后第7天處死大鼠，取同側(cè)L4背根神經(jīng)節(jié);Naive組不做任何手術(shù)，直接取右側(cè)L4背根神經(jīng)節(jié);Sha組僅暴露坐骨神經(jīng)，術(shù)后第7天處死大鼠，直接取右側(cè)L4背根神經(jīng)節(jié)。采用esternblt法檢測脊髓L4背根神經(jīng)節(jié)GDNF的蛋白表達(dá)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)1：與Sha組相比，I組大鼠從術(shù)后第3天開場至術(shù)后21天內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)T和PL均顯著降低(P0.05或P0.01)。實(shí)驗(yàn)2：與Sha組相比，I組在L4背根神經(jīng)節(jié)的GDNF表達(dá)明顯減少(P0.01)。結(jié)論I大鼠的L4背根神經(jīng)節(jié)的GDNF表達(dá)減少，可能參與I所致神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病

3、機(jī)制。【關(guān)鍵詞】慢性收縮性損傷;神經(jīng)病理性疼痛;膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子;背根神經(jīng)節(jié);動(dòng)物模型;大鼠Abstrat：bjetiveTinvestigatetheexpressinfglialellline-derivedneurtrphifatr(GDNF)inthefurthlubar(L4)drsalrtganglin(DRG)inratsithneurpathipaininduedbyhrninstritiveinjury(I).ethdsExperient1:24Sprague-DaleyratsererandlydesignatedasNaivegrup,ShagrupandIgru

4、p(n=8eah).TheIdelasestablishedbylseligatinarundtherightL4siatinerveasdesribedbyBennett.IntheShagrupnlytherightsiatinerveasexpsedandintheNaivegrupntreatentasperfred.ehanialithdraalthreshld(T)usingVnFreyfilaentandpaithdraallateny(PL)usingradiantheatappliedttherighthindplantarsurfaeereeasured2daysbefre

5、surgery(baseline)and1,3,5,7,14and21daysafterperatin(iththeNaivegrupeasuredattherrespndingtiepints).Experient2:18Sprague-DaleyratseredividedintNaive,ShaandIgrups(n=6eah).TheanialdelasestablishediththeIgrup.TheratsinIgrupseredeapitatednthe7thdayafterperatinandtherightL4DRGasreved;intheNaivegruptherats

6、underentnperatinandtherightL4DRGasdiretlyreved,andintheShagruptherightsiatinerveasnlyexpsedandtherightL4DRGastakenut.TheexpressinfGDNFfspinalL4DRGasdeterinedbyesternblt.ResultsInExperient1,TandPLfratsintheIgruperesignifiantlylerthanthseintheShagrupfrday3tday21(P0.05rP0.01).Inexperient2,theexpressinf

7、GDNFintherightL4DRGsignifiantlydereasedasparedtthatftheShagrup(P0.01).nlusinThednregulatinfGDNFftheL4DRGinratsasprbablyinvlvedintheehanisfIinduedneurpathipain.Keyrds:hrninstritiveinjury;neurpathipain;glialellline-derivedneurtrphifatr;drsalrtganglin;anialdel;rats膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glialellline-derivedneurt

8、rphifatr,GDNF)于1993年由Lin等1從大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系B49的培養(yǎng)液中首先純化并命名，其受體包括GFR1和Ret。研究說明，GDNF是最強(qiáng)的多巴胺能神經(jīng)營養(yǎng)因子，對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和感覺神經(jīng)元有強(qiáng)大的神經(jīng)營養(yǎng)作用。本研究通過制備大鼠慢性收縮性損傷(hrninstritiveinjury,I)所致的神經(jīng)病理性疼痛模型，采用esternblt觀察I大鼠GDNF在脊髓背根神經(jīng)節(jié)中的蛋白表達(dá)，以討論其可能的發(fā)病機(jī)制。1材料和方法1.1制備I動(dòng)物模型SD大鼠(體重250300g)在標(biāo)準(zhǔn)條件下(標(biāo)準(zhǔn)溫度、濕度、12h明暗周期，可自由攝食攝水)飼養(yǎng)，腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉40g/kg后，按Benn

9、ett法2結(jié)扎坐骨神經(jīng)主干制備I模型。暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)，在該神經(jīng)主干部位，用4-0鉻制羊腸線松結(jié)扎4道，間隔1.02.0，部分覆蓋青霉素粉末后，用細(xì)絲線縫合肌肉及皮膚，術(shù)后大鼠置于安靜、溫暖、避強(qiáng)光環(huán)境喂養(yǎng)。1.2動(dòng)物分組和觀察指標(biāo)1.2.1實(shí)驗(yàn)124只SD大鼠隨機(jī)分為正常組(Naive組)、假手術(shù)組(Sha組)和I組(每組n=8)。Naive組不做任何手術(shù);Sha組僅暴露坐骨神經(jīng);I組制備I模型。分別測定Sha組和I組術(shù)前2天(根底值)及術(shù)后第1、3、5、7、14、21天(Naive組那么在相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn))大鼠同側(cè)(本實(shí)驗(yàn)為右側(cè))后足機(jī)械縮足反射閾值(T，單位：g)和熱縮足反射埋伏期(PL，

10、單位：s)。1.2.2實(shí)驗(yàn)218只SD大鼠，隨機(jī)分為正常組(Naive組)、假手術(shù)組(Sha組)和I組(每組n=6)。Naive組不做任何手術(shù)，直接取右側(cè)L4背根神經(jīng)節(jié);Sha組僅暴露坐骨神經(jīng)，術(shù)后第7天處死大鼠取同側(cè)L4背根神經(jīng)節(jié);I組制備I模型于術(shù)后第7天處死大鼠取同側(cè)L4背根神經(jīng)節(jié)，采用esternblt方法檢測GDNF的蛋白表達(dá)。1.3esternblt方法1.3.1胞膜蛋白的提取樣本先放入預(yù)冷的勻漿液，低溫勻漿，4800g離心15in，取上清液，4105g離心1h。離心沉淀參加勻漿液，沉淀充分溶解后在4105g離心1h，上清即為胞膜蛋白。1.3.2電泳、條帶分析按Bradfrd法測定

11、樣本蛋白濃度后，參加1/4體積的5倍樣本緩沖液，95水浴變性5in。取等量40g蛋白樣本加至12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上恒壓電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。分別參加5%脫脂奶粉TBST配制的一抗(1200兔抗鼠GDNF,Santaruz公司)，在搖床平臺(tái)上于室溫孵育4h，TBST漂洗濾膜3次，每次10in。再參加小?？雇枚?1500,Santaruz公司)，于37平緩搖動(dòng)溫育1h。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(EL)檢測信號(hào)。濾膜浸入含化學(xué)發(fā)光試劑A、B的水溶液中激發(fā)熒光，拍攝并掃描照片。反響條帶作半定量分析。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)均以s表示，所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0軟件處理，組內(nèi)比擬用t檢驗(yàn)，組間

12、比擬用單因素方差分析(ANVA)，P0.05認(rèn)為差異有顯著性。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2結(jié)果2.1各組大鼠T的變化與術(shù)前根底值和Sha組比擬，I組大鼠從術(shù)后第3天開場至術(shù)后21天內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)T均顯著降低(P0.05或P0.01)。Naive組和Sha組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)T與術(shù)前根底值比擬差異無顯著性(P0.05)。見表1。表1各組大鼠后足T的變化與術(shù)前根底值和Sha組比擬：*P0.05，*P0.012.2各組大鼠后足PL的變化3組間PL根底值比擬差異無顯著性(P0.05)。與術(shù)前根底值和Sha組比擬，I組大鼠從術(shù)后第3天開場至術(shù)后21天內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)PL均顯著降低(P0.01)。Naive組和Sha組術(shù)后各

13、時(shí)間點(diǎn)PL與術(shù)前根底值比擬差異無顯著性(P0.05)。見表2。2.3各組大鼠L4背根神經(jīng)節(jié)GDNF蛋白表達(dá)與Sha組比擬，I組L4的背根神經(jīng)節(jié)中GDNF蛋白表達(dá)明顯減少(P0.01)。見圖1。表2各組大鼠后足PL的變化3討論國際疼痛研究會(huì)將由于外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的直接損傷或功能紊亂引起的疼痛稱為神經(jīng)病理性疼痛3。由于神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、病癥多樣，目前臨床上尚缺乏有效的治療藥物和方法。因此，研究其發(fā)病機(jī)制和尋找可以消除神經(jīng)病理性疼痛的藥物已成為近年研究的熱點(diǎn)問題之一。神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病的根本過程是傷害性刺激在外周初級(jí)感覺神經(jīng)元換能，轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，經(jīng)脊髓、腦干和丘腦的傳遞和調(diào)制，最后在大腦

14、皮質(zhì)產(chǎn)生痛覺4。脊髓背根神經(jīng)節(jié)作為痛覺傳入的第1級(jí)神經(jīng)元在痛覺傳導(dǎo)通路中起著極其重要的作用。臨床上神經(jīng)病理性疼痛患者常表現(xiàn)出痛覺超敏、觸誘發(fā)痛及自發(fā)痛現(xiàn)象。外周神經(jīng)損傷后粗大的A纖維迅速再生，很快長芽侵入脊髓后角層，與層中正常情況下僅與纖維形成突觸聯(lián)絡(luò)的神經(jīng)元建立新的突觸聯(lián)絡(luò)，結(jié)果導(dǎo)致上位神經(jīng)元對(duì)非傷害刺激的異常反響，背根神經(jīng)節(jié)興奮性增高，出現(xiàn)異常的、反復(fù)的電活動(dòng)。這是痛敏形成的神經(jīng)解剖學(xué)及電生理學(xué)基矗背根神經(jīng)節(jié)中主要含有兩類神經(jīng)元，即大神經(jīng)元和中、小神經(jīng)元。大神經(jīng)元的軸突是有髓鞘的，傳遞軀體的本體感覺及觸壓覺;而中、小神經(jīng)元的軸突那么無髓鞘，傳遞軀體的痛溫覺和內(nèi)臟感覺。感受與傳遞傷害性刺激的是背根神經(jīng)節(jié)中的中、小神經(jīng)元的纖維即A纖維和纖維。最近的研究發(fā)現(xiàn)A纖維和纖維的功能可被GDNF調(diào)控5。GDNF通過靶細(xì)胞的逆向軸突運(yùn)輸調(diào)節(jié)脊髓神經(jīng)細(xì)胞的代謝及功能活動(dòng)，特別對(duì)小神經(jīng)元纖維的中樞突具有營養(yǎng)支持作用，抑制其退變，使之保持正常的突觸聯(lián)絡(luò)6。在本研究中I大鼠模型成功的第7天，L4背根神經(jīng)節(jié)的GD