軍團(tuán)菌的分離培養(yǎng)與鑒定 福建省疾病預(yù)防控制中心

1、軍團(tuán)菌的分離培養(yǎng)與鑒定 福建省疾病預(yù)防控制中心2022年6月3日軍團(tuán)菌革蘭陰性桿菌,淺紅色的短桿菌，直徑0.30.5m，長(zhǎng)約1.25m或更長(zhǎng)，菌體一端有鞭毛.在含L-半胱氨酸和焦磷酸鐵的BCYE瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，通常需要在37 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-10天。生長(zhǎng)形成的菌落一般呈白色，也可能會(huì)從紫色變?yōu)樗{(lán)色，或是灰綠色。 初步在BCYE瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落為刻花玻璃樣，具有多型性.軍團(tuán)菌軍團(tuán)菌軍團(tuán)菌電鏡圖片軍團(tuán)菌科、屬、種、血清型軍團(tuán)菌科 (Legionellaceae ）Legionella / Fluoribacter bozemanii / Tatlockia micdadei 軍團(tuán)菌

2、屬：16s rRNA分析表明，在蛋白細(xì)菌系亞群中，軍團(tuán)菌科只有一個(gè)軍團(tuán)菌亞群。與引起Q熱病的coxiella burneti(貝氏克斯體）親緣關(guān)系最近，二者具有同樣的細(xì)胞內(nèi)生活方式，可以利用共同的基因感染宿主細(xì)胞。軍團(tuán)菌種：現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)50個(gè)種（species），70多個(gè)血清型（serogroups)，至少有20個(gè)種可引起人感染。 種名發(fā)現(xiàn)時(shí)間 種名發(fā)現(xiàn)時(shí)間 種名發(fā)現(xiàn)時(shí)間 Legionella pneumophila1979Legionella maceachernii 1985Legionella geestiana 1993Legionella bozemanae 1980Legionella

3、 parisiensis 1985Legionella londiniensis 1993Legionella dumoffii 1980Legionella rubrilucens 1985Legionella nautarum 1993Legionella gormanii 1980Legionella santicrucis 1985Legionella quateirensis 1993Legionella micdadei 1980Legionella spiritensis 1985Legionella worsleiensis 1993Legionella pittsburghe

4、nsis 1980Legionella steigerwaltii 1985Legionella lansingensis 1994Legionella jordanis 1982Legionella israelensis 1986Legionella lytica 1996Legionella longbeachae 1982Legionella birminghamensis1988Legionella waltersii 1996Legionella oakridgensis 1983Legionella brunensis 1989Legionella taurinensis 199

5、9Legionella wadsworthii 1983Legionella cincinnatiensis1989Legionella beliardensis 2001Legionella feeleii 1984Legionella moravica 1989Legionella drozanskii 2001Legionella sainthelensi 1984Legionella quinlivanii 1990Legionella fallonii 2001Legionella anisa 1985Legionella tucsonensis 1990Legionella gre

6、silensis 2001Legionella cherrii 1985Legionella adelaidensis 1991Legionella rowbothamii 2001Legionella erythra 1985Legionella fairfieldensis 1991Legionella busanensis 2003Legionella hackeliae 1985Legionella gratiana 1991Legionella drancourtii 2004Legionella jamestowniensis1985Legionella shakespearei

7、1992軍團(tuán)菌種SpeciesNo. of serogroupsNo. associated with disease1. L. pneumophila15152. L. bozemanii223. L. dumoffii114. L. micdadei115. L. longbeachae226. L. jordanis117. L. wadsworthii118. L. hackeliae229. L. feeleii2210. L. maceachernii1111. L. birminghamensis1112. L. cincinnatiensis1113. L. gormanii1

8、114. L. sainthelensi2215. L. tucsonensis1116. L. anisa1117. L. lansingensis1118. L. erythra2119. L. parisiensis1120. L. oakridgensis1120個(gè)種的軍團(tuán)菌可引起人疾病軍團(tuán)菌操作生物安全性應(yīng)用的試劑須符合有毒物質(zhì)操作要求和相關(guān)規(guī)定。生物安全級(jí)實(shí)驗(yàn)室，最好在安全柜中操作。操作人員培訓(xùn)。菌種保存?？筛腥救祟惖母咧虏⌒圆≡⑸锞ǘ荆┓N或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定病原菌名稱危害程度分類實(shí)驗(yàn)活動(dòng)所需生物安全實(shí)驗(yàn)室級(jí)別運(yùn)輸包裝分類學(xué)名中文名大量活菌操作動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)樣本檢測(cè)非感染性材料實(shí)

9、驗(yàn)A/BUN 編號(hào)Legionella pneumophila嗜肺軍團(tuán)菌第三類BSL-2ABSL-2BSL-2BSL-1BUN 3373樣本的采集和運(yùn)輸（一）標(biāo)本的種類 （二）標(biāo)本的運(yùn)輸和相關(guān)生物安全要求標(biāo)本的種類 環(huán)境水標(biāo)本：空調(diào)冷卻塔水、冷凝水,溫泉水,淋浴水, 加濕器水； 病人組織標(biāo)本:如痰,支氣管灌洗液,胸水,血液等標(biāo)本。 1983年新疆從一癱患羔羊后肢中分離到軍團(tuán)菌。標(biāo)本的運(yùn)輸和相關(guān)生物安全要求在周圍環(huán)境溫度下運(yùn)送水樣標(biāo)本,不必冷凍,但要防止受熱和陽(yáng)光,標(biāo)本要盡可能快或最好在兩天內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室,室溫下(21+3)貯藏在實(shí)驗(yàn)室或其他地方。對(duì)于臨床標(biāo)本，最好立即做預(yù)期實(shí)驗(yàn)，如不能馬上進(jìn)行，

10、應(yīng)放在-20凍存?zhèn)溆谩Ｋ畼訕?biāo)本中軍團(tuán)菌的分離方法檢測(cè)依據(jù): 1 、ISO-11731水質(zhì)軍團(tuán)菌檢測(cè) 2 、 公共場(chǎng)所集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng) 衛(wèi)生規(guī)范中的集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)冷卻水、冷凝水中嗜肺軍團(tuán)菌的檢驗(yàn)方法見(jiàn)附錄A。 適用于各種環(huán)境標(biāo)本軍團(tuán)菌檢測(cè) ，包括： 飲用水、工業(yè)用水、天然水以及一些如沉積物、沉淀物、軟泥等物質(zhì)。軍團(tuán)菌水質(zhì)檢測(cè)概括采樣濃縮培養(yǎng)分離鑒定軍團(tuán)菌檢測(cè)所需準(zhǔn)備基本試劑培養(yǎng)基（GVPC，BCYE,BCYE-CYS)試劑 (生化試劑、甲醛的鹽溶液）酸緩沖液（0.2mol/L KCL-HCL)，堿緩沖液（0.03mol/L KOH）血清學(xué)試劑標(biāo)本濃縮所需準(zhǔn)備儀器設(shè)備過(guò)濾濾器及漏斗，過(guò)濾裝置需能

11、夠承受高壓。正壓膜蠕動(dòng)過(guò)濾泵，能夠控制流速。尼龍或聚碳酸酯濾膜 硅膠管 離心機(jī) 離心力能夠達(dá)到（6000100）g,要有安全蓋。漩渦振蕩器 轉(zhuǎn)速至少能夠達(dá)到（2005）r/min。培養(yǎng)檢測(cè)所需準(zhǔn)備材料直徑大約為90mm或100mm的無(wú)菌培養(yǎng)皿培養(yǎng)箱，CO2能夠恒溫保持在（361）。水浴箱，能夠保持在（501）顯微鏡或熒光顯微鏡。樣品采樣準(zhǔn)備材料玻璃、聚乙烯或類似的容器瓶：滅菌處理。水樣一般采集為250-500ml，收集在容器瓶中。如果所用的容器，如聚乙烯瓶，不能高壓，可用流動(dòng)的熱水（不低于70）或蒸汽進(jìn)行巴斯德氏消毒，時(shí)間不低于5分鐘。小的無(wú)菌容器瓶：可用來(lái)收集淤泥、沉淀物或沉積物。廣口的容器

12、：用來(lái)收集淤泥等，要有螺絲蓋。滅菌棉拭子。一般建議用塑料包裝的容器采樣后樣品處理方法與步驟樣品處理1. 沉淀或離心：如有雜質(zhì)可靜置沉淀或1000r/min離心1min去除。2. 過(guò)濾：將經(jīng)沉淀或離心的樣品通過(guò)孔徑0.220.45m濾膜過(guò)濾，取下濾膜置于15ml滅菌水中，充分洗脫，備用。3.熱處理：取1ml洗脫樣品置50水浴加熱30min。4.酸處理：取5ml洗脫樣品，調(diào)pH至2.2，輕輕搖勻，放置5min。ISO-11731水質(zhì)軍團(tuán)菌檢測(cè)濃縮標(biāo)本酸處理酸緩沖液：仔細(xì)地量取17.4ml濃鹽酸加到1L蒸餾水中，配成0.2mol/L的鹽酸緩沖液；稱14.9gKCl加到1L蒸餾水中，配成0.2mol/

13、L的KCl溶液。將3.9ml 0.2mol/L的鹽酸溶液和25ml 0.2mol/L的KCl溶液混合，用1mol/L的KOH溶液調(diào)pH至2.20.2，裝在一個(gè)帶塞的玻璃瓶?jī)?nèi)，于室溫暗處貯存，不要超過(guò)1個(gè)月。將110ml樣品（濃縮或未濃縮的）放入帶有螺旋帽的容器中，再將其6000g離心10min或3000g離心30min。用無(wú)菌吸管吸取上清，使體積變?yōu)樵瓉?lái)的一半。用振蕩器或用力混合，使沉淀重懸。加入酸緩沖液使體積和原來(lái)相同,并輕晃搖勻靜置5min。樣品濃縮離心過(guò)濾接種酸處理 熱處理水樣的正壓膜過(guò)濾法安放濾膜；過(guò)濾；取膜；洗膜。水樣的離心將200ml左右樣品倒入容積為300500ml的無(wú)菌離心瓶中

14、；6000g離心10min，或者3000g離心30min，離心溫度在1525之間；無(wú)菌操作去除上清；用520ml溶液或無(wú)菌蒸餾水將沉淀重懸。水樣濃縮物的貯存最好對(duì)樣品立刻進(jìn)行分析；標(biāo)本于（62）儲(chǔ)藏最多不超過(guò)14天。 對(duì)于軍團(tuán)菌來(lái)說(shuō)，如果儲(chǔ)藏于06，這種損失是最明顯的。而且，溫度在20或20以上時(shí)，異養(yǎng)生物的生長(zhǎng)速度就會(huì)變快。 濃縮標(biāo)本熱處理向無(wú)菌容器中放入（10.5）ml（濃縮或未濃縮）的標(biāo)本。在（501）水浴中放置（302）min。軍團(tuán)菌培養(yǎng)基Muller-Hinton瓊脂第一次分離出嗜肺軍團(tuán)菌使用的培養(yǎng)基活性炭酵母抽提物瓊脂，活性炭替代培了淀粉以去除培養(yǎng)基的毒性，并且氨基酸也逐漸被酵母抽

15、提物替代CYE瓊脂CYE瓊脂加入-酮戊二酸BCYE瓊脂BCYE瓊脂中含有選擇性抗生素GVPC瓊脂軍團(tuán)菌培養(yǎng)基 酵母浸出物（細(xì)菌級(jí)） 10.0g 瓊脂 12.0g 活性炭 2.0g -酮戊二酸 1.0g ACES (2-乙?；?2-氨基乙烷磺酸) 10.0g KOH（顆粒型） 2.8g L-半胱氨酸鹽酸鹽 0.6g 焦磷酸鐵 0.4g 蒸餾水 補(bǔ)充至1000mlBCYE培養(yǎng)基L-半胱氨酸和焦磷酸鐵溶液稱取0.6g L-半胱氨酸鹽酸鹽和0.4g焦磷酸鐵分別溶解于10ml蒸餾水中，制備新鮮的L-半胱氨酸鹽酸鹽溶液和焦磷酸鐵溶液。分別通過(guò)0.22m的濾膜過(guò)濾除菌。貯存于無(wú)菌容器中，-20左右儲(chǔ)存不得超

16、過(guò)三個(gè)月。BCYE-培養(yǎng)基配制將顆粒狀A(yù)CES放入500ml蒸餾水中溶解。量取480ml蒸餾水，加入全部2.8gKOH顆粒，輕搖至溶解。將以上兩種溶液混合，制成ACES緩沖液,用0.1mol/L KOH和0.1mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)PH至6.9-7.0ACES緩沖液中加入活性炭、酵母浸出物、-酮戊二酸。搖勻。加入瓊脂，微波稍化后，121高壓15min。高壓后，室溫或水浴中冷卻至50左右。在無(wú)菌條件下加入L-半胱氨酸溶液和焦磷酸鐵溶液。按20ml量倒入直徑為90100mm的平板中，培養(yǎng)基的最終pH值大約為6.9左右。待平板中的濕氣干燥后，4左右儲(chǔ)存于閉光的密閉容器中，最多可儲(chǔ)存4周。GVPC

17、選擇性培養(yǎng)基BCYE-瓊脂培養(yǎng)基中添加下列抗生素萬(wàn)古霉素 0.001g/L多粘菌素B 80000iu/L放線菌酮 0.08g/L無(wú)胺甘氨酸 3g/LBCYE-Cys培養(yǎng)基 為不含L-半胱氨酸的酵母浸出物、炭粉培養(yǎng)基。按照配制BCYE培養(yǎng)基的方法配制，不加L-半胱氨酸。標(biāo)本肺組織、支氣管灌洗液、血液、痰、胸水、胸腔引流物水源血清 處理與制備水樣處理與制備血清學(xué)檢測(cè)方法：*間接熒光抗體染色法*試管凝集試驗(yàn)*微量凝集試驗(yàn)（參考）*DOT-ELISA法*間接血凝試驗(yàn)（參考）*ELISA法接種軍團(tuán)菌BCYE培養(yǎng)基接種軍團(tuán)菌選擇性GVPC培養(yǎng)基37，5%CO2，培養(yǎng)3-14天挑可疑菌落革蘭氏染色涂片鏡檢3

18、7,5%CO2,培養(yǎng)3-14天革蘭氏染色陰性桿菌革蘭氏染色陽(yáng)性桿菌 純培養(yǎng) 棄去 確認(rèn)試驗(yàn) 血清玻片凝集試驗(yàn) PCR檢測(cè) 生化試驗(yàn) 選擇培養(yǎng)基的接種一個(gè)GVPC培養(yǎng)基平板上可以接種0.10.5ml(濃縮或未濃縮) 未經(jīng)處理的樣品。用無(wú)菌的涂抹器將液體均勻的涂抹在培養(yǎng)基表面。用同樣的方法盡可能快地將經(jīng)過(guò)熱處理的0.10.5ml標(biāo)本接種在另外一塊GVPC培養(yǎng)基平板上。再用同樣的方法盡可能快地將經(jīng)過(guò)酸處理的0.10.5ml標(biāo)本接種到第三塊GVPC培養(yǎng)基平板上。500ml水樣過(guò)濾濃縮法將500ml水樣于0.22um濾膜過(guò)濾然后放于5ml無(wú)菌水中超聲波振動(dòng)3分鐘=濃縮樣本或高速離心濃縮法將200ml水樣

19、置于離心機(jī)6000g離心10分鐘，15-25 =濃縮樣本直接涂布法于GVPC（2個(gè)平板）上分別涂布0.2ml原液用PBS緩沖液0.01mol/L（PH7.2）稀釋1：10的樣本酸處理法2ml濃縮液+2ml酸緩沖液（PH2.0）搖勻50.5分鐘熱處理法2ml濃縮液于501水浴301分鐘直接涂布法于GVPC平板上涂布0.1ml濃縮液，用PBS緩沖液稀釋1：10的樣本 涂布：0.2ml于GVPC平板涂布：0.2ml于GVPC平板孵育、平板觀察及確認(rèn)接種標(biāo)本培養(yǎng)接種過(guò)的培養(yǎng)基靜置直至接種物被完全吸收，然后將平板倒置，在（361）培養(yǎng)7-10天。為了保證培養(yǎng)箱內(nèi)的空氣的濕度，可以在培養(yǎng)箱內(nèi)放置一個(gè)盛水的

20、碟子。在每次觀察培養(yǎng)物時(shí)，向碟子內(nèi)注滿新鮮的水（根據(jù)需要）。在含2.5-5.0% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)有利于軍團(tuán)菌的生長(zhǎng)。孵育6個(gè)GVPC平板/每份樣本37，5%CO2，培養(yǎng)3-10天 菌落驗(yàn)證：從每一個(gè)平皿上挑取2個(gè)可疑菌落，接種血平板及接種BCYE和L半光氨酸缺失的BCYE瓊脂平板，3537培養(yǎng)2天，凡在BCYE瓊脂平板上生長(zhǎng),而在L半光氨酸缺失的BCYE瓊脂平板及血平板不生長(zhǎng)的則為軍團(tuán)菌菌落。平板的檢查觀察結(jié)果：在3-10天的培養(yǎng)期間內(nèi)，每24天至少觀察3次，因?yàn)檐妶F(tuán)菌生長(zhǎng)緩慢，易被其它菌掩蓋。軍團(tuán)菌菌落特點(diǎn)（1）軍團(tuán)軍菌落通常呈灰白色，但也能呈藍(lán)色、灰綠色、深褐色或深紅色。一般表面光滑濕

21、潤(rùn)，邊緣完整，并顯示典型的毛玻璃樣外觀。在紫外燈下，某些種的菌落（博杰曼軍團(tuán)菌、高曼軍團(tuán)菌、杜莫夫軍團(tuán)菌、安綏軍團(tuán)菌、奇銳軍團(tuán)菌、斯泰戈瓦爾特軍團(tuán)菌、格瑞梯納軍團(tuán)菌、圖森軍團(tuán)菌、巴黎軍團(tuán)菌）能自動(dòng)發(fā)出白色的耀眼熒光；某些種的軍團(tuán)菌也能發(fā)出紅光。軍團(tuán)菌菌落特點(diǎn)（2）嗜肺軍團(tuán)菌的菌落呈暗淡的綠色，并常伴有淺黃色。為了避免軍團(tuán)菌被殺死，平板暴露于紫外燈下不能超過(guò)規(guī)定時(shí)間。值得注意的是，新發(fā)現(xiàn)的某些種的軍團(tuán)菌所具有的特征可能會(huì)和上述特征有所區(qū)別。 軍團(tuán)菌菌落特點(diǎn)可疑軍團(tuán)菌菌落的進(jìn)一步鑒定BCYE或其他培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)革蘭染色鏡檢生化鑒定PCR檢測(cè)軍團(tuán)菌特異性基因片段免疫熒光的方法確定軍團(tuán)菌的種類 BC

22、YE或其他培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)（1）至少?gòu)拿繅KGVPC平板上挑選出兩個(gè)典型的軍團(tuán)菌菌落，在BCYE和BCYE-Cys培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)要在兩種培養(yǎng)基上同時(shí)進(jìn)行。在（361）至少培養(yǎng)兩天。凡是在BCYE培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而在BCYE-Cys培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)的菌落即可初步認(rèn)定為軍團(tuán)菌。 BCYE或其他培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)（2）營(yíng)養(yǎng)瓊脂或血瓊脂培養(yǎng)基可以代替BCYE-Cys培養(yǎng)基。如果在這三種培養(yǎng)基上都不生長(zhǎng)，原來(lái)選擇性培養(yǎng)基上的可疑軍團(tuán)菌菌落應(yīng)該繼續(xù)傳代培養(yǎng)。橡樹嶺軍團(tuán)菌和幽靈湖軍團(tuán)菌在初次分離培養(yǎng)時(shí)需要L-半胱氨酸和鐵離子，但隨后在L-半胱氨酸缺失時(shí)生長(zhǎng)微弱。BCYE培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)革蘭染色鏡檢軍團(tuán)菌是

23、革蘭染色陰性，淺紅色的短桿菌，直徑0.30.5m，長(zhǎng)約1.25m或更長(zhǎng)，菌體一端有鞭毛，長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后鞭毛可能變成長(zhǎng)絲狀。短桿狀長(zhǎng)絲狀軍團(tuán)菌生化鑒定 軍團(tuán)菌生化特性生化試驗(yàn)結(jié)果觸酶/弱+氧化酶-/+硝酸鹽還原-尿素酶-明膠液化+水解馬尿酸+淀粉水解弱+尿素酶試驗(yàn)陰性：培養(yǎng)基不變色陽(yáng)性：培養(yǎng)基由黃色變?yōu)榧t色硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性：無(wú)紅色出現(xiàn)陽(yáng)性：呈現(xiàn)紅色 進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)必須有未接種的培養(yǎng)基管作為陰性對(duì)照。-萘胺具有致 癌性、故使用時(shí)應(yīng)加注意。 明膠液化試驗(yàn) 將待試菌培養(yǎng)物穿刺接種于明膠高層約2/3深度。于361 2.5-5.0%CO2培養(yǎng)2-3天后將培養(yǎng)基置于4 30分鐘，取出觀察。 陰性：凝固 陽(yáng)性：不

24、凝固馬尿酸水解試驗(yàn)將待鑒定菌株，于0.4mL馬尿酸鈉溶液中，制成濃厚菌懸液，于361水浴培養(yǎng)2h后，沿管壁加入3.5水合印三酮試劑，形成兩層，如果產(chǎn)生藍(lán)紫色至深紫色，為陽(yáng)性反應(yīng)。陽(yáng)性陰性氧化酶試驗(yàn)陰性陽(yáng)性觸酶試驗(yàn)取細(xì)菌至載玻片上涂抹，加1-2滴3%過(guò)氧化氫水溶液。 若會(huì)迅速冒出氣泡，則表示此細(xì)菌含有觸酶，屬于陽(yáng)性反應(yīng)。淀粉酶水解試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)：（淀粉被分解）瓊脂培養(yǎng)基呈深藍(lán)色、菌落或培 養(yǎng)物周圍出現(xiàn)無(wú)色透明環(huán)陰性反應(yīng)：菌落周圍無(wú)透明環(huán)確定軍團(tuán)菌的種型 Oxoid 的乳膠試劑盒可以鑒定出： 嗜肺軍團(tuán)菌血清1型; 嗜肺軍團(tuán)菌血清2-14混合型； L. longbeachae1和2型 ，L. bozemanii1和2型，L. dumoffii，L. gormanii，L. jordanis，L. micdadei， L. a