膽汁酸抗艱難類梭菌感染作用機(jī)制和應(yīng)用前景

1、膽汁酸抗艱難類梭菌感染作用機(jī)制和應(yīng)用前景艱難類梭菌(Clostridioides difficile，C.difficile)是一種革蘭氏陽性厭氧芽孢桿菌，屬于條件致病菌，毒素A和毒素B是其主要致病因子，可損傷患者腸壁，誘發(fā)炎癥反應(yīng)。艱難類梭菌感染(Clostridioides difficileinfection，CDI)的常見臨床癥狀為腹瀉，也可伴有發(fā)熱和腹痛等，嚴(yán)重者可表現(xiàn)為偽膜性腸炎、中毒性巨結(jié)腸、腸穿孔和膿毒血癥等，甚至死亡?？股氐氖褂檬且餋DI的主要原因，抗生素可引起腸道菌群紊亂，從而導(dǎo)致耐藥C.difficile過度增殖。膽汁酸作為腸道菌群衍生的代謝物，被認(rèn)為是腸道菌群與宿主

2、溝通的關(guān)鍵信號分子，其對宿主的正常生理和免疫功能起著重要作用。目前，糞便菌群移植是復(fù)發(fā)性CDI最有效的治療方法，其主要的作用機(jī)制之一即通過恢復(fù)腸道菌群、調(diào)節(jié)膽汁酸代謝抑制C.difficile生長。因此，探索膽汁酸在CDI發(fā)病機(jī)制中的作用及其作為CDI新療法的潛在價(jià)值尤為重要。本文通過總結(jié)膽汁酸在CDI發(fā)病機(jī)制中的作用，探討膽汁酸對CDI新的治療選擇的潛在影響。一、膽汁酸對CDI的直接作用1膽汁酸抑制C.difficile菌體生長和芽孢萌發(fā)：人類結(jié)腸管腔滿足厭氧條件，C.difficile等專性厭氧細(xì)菌能在其中生存。C.difficile形成的芽孢對惡劣環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)，在高溫、有氧和常用消毒

3、劑條件下可以存活，更便于傳播。芽孢形成轉(zhuǎn)錄因子Spo0A(stage 0 sporulation protein A)對C.difficile芽孢的產(chǎn)生過程至關(guān)重要，其失活可導(dǎo)致C.difficile失去芽孢形成能力。Spo0A的表達(dá)水平受鳥苷三磷酸-感應(yīng)轉(zhuǎn)錄多效性抑制因子(guanosine triphosphate-sensing transcriptional pleiotropic repressor，CodY)和代謝物調(diào)控蛋白A(catabolite control protein A，CcpA)調(diào)控，其中營養(yǎng)調(diào)節(jié)蛋白CodY是一個轉(zhuǎn)錄抑制因子，能夠顯著抑制C.difficile芽孢

4、形成相關(guān)操縱子的轉(zhuǎn)錄；多效調(diào)控因子CcpA是碳水化合物代謝抑制劑，當(dāng)C.difficile在含有葡萄糖條件下培養(yǎng)時，CcpA可直接抑制Spo0A的表達(dá)，進(jìn)而使其產(chǎn)生的毒素減少。一般情況下，C.difficile芽孢的萌發(fā)和菌體的生長只發(fā)生在下消化道，腸道內(nèi)容物中尤其是膽汁酸會誘導(dǎo)C.difficile芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)細(xì)胞，這一過程由CspBAC基因位點(diǎn)調(diào)控。C.difficile芽孢上存在的膽汁酸受體梭菌絲氨酸蛋白酶(clostridial serine protease，Csp)C主要由CspBAC基因位點(diǎn)編碼，該基因位點(diǎn)還編碼另一種由枯草桿菌蛋白酶家族蛋白中CspB和CspA組成的雜合蛋白C

5、spB-CspA，并且CspBAC基因與芽孢萌發(fā)所必需的皮質(zhì)層裂解酶SleC的激活有關(guān)。培養(yǎng)基中加入初級結(jié)合膽汁酸?；悄懰峥蓸O大地促進(jìn)糞便中C.difficile菌體生長和芽孢萌發(fā)，這一過程主要是由?；悄懰崤cC.difficile表面的CspC結(jié)合后將信號傳遞給CspB，CspB激活SleC使C.difficile芽孢皮質(zhì)層退化，最終導(dǎo)致新的營養(yǎng)細(xì)胞生長(圖1)。游離的初級膽汁酸對C.difficile有不同的作用，膽酸可促進(jìn)C.difficile芽孢萌發(fā)和菌體生長，而鵝去氧膽酸抑制C.difficile芽孢萌發(fā)的能力明顯強(qiáng)于膽酸誘導(dǎo)C.difficile芽孢萌發(fā)的能力，該過程主要由CspC受

6、體介導(dǎo)。相反，次級膽汁酸如去氧膽酸能夠通過下調(diào)Spo0A的表達(dá)降低C.difficile產(chǎn)生芽孢的效率，其余的次級膽汁酸如石膽酸、異石膽酸、熊去氧膽酸和豬去氧膽酸在生理濃度下也能夠抑制牛磺膽酸介導(dǎo)的C.difficile芽孢萌發(fā)，這種抑制作用呈劑量依賴性，抑制程度和抗性程度因菌株和核型不同而存在差異(圖2)。注：背景淺藍(lán)色為艱難類梭菌芽孢形成階段，淺黃色為艱難類梭菌芽孢萌發(fā)階段。P為磷酸化修飾；Spo0A為芽孢形成轉(zhuǎn)錄因子；CspC為梭菌絲氨酸蛋白酶C；SleC為皮質(zhì)層裂解酶；CspB為梭菌絲氨酸蛋白酶B圖1艱難類梭菌芽孢的形成和萌發(fā)過程注：CYP27A1為膽固醇27羥化酶1；CYP7A1為膽

7、固醇7羥化酶1；CYP7B1為氧固醇7羥化酶1；CDCA為鵝去氧膽酸；CYP8B1為膽固醇12羥化酶1；CA為膽酸；TCDCA為牛磺鵝去氧膽酸；GCDCA為甘氨鵝去氧膽酸；TCA為?；悄懰幔籊CA為甘氨膽酸；BSH為膽鹽水解酶；HSDH為羥基類固醇脫氫酶；UDCA為熊去氧膽酸；isoalloLCA為石膽酸衍生物；5AR為5-還原酶；3HSDH為3-羥基類固醇脫氫酶；LCA為石膽酸；DCA為去氧膽酸；FXR為法尼酯X受體；TNF-為腫瘤壞死因子-；IL為白細(xì)胞介素；IFN-為干擾素；TGR5為G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5圖2膽汁酸的體內(nèi)代謝及其代謝產(chǎn)物對艱難類梭菌芽孢萌發(fā)、菌體生長和毒素產(chǎn)生的作用2膽

8、汁酸抑制C.difficile毒素產(chǎn)生：毒素的產(chǎn)生對C.difficile導(dǎo)致感染至關(guān)重要。為了應(yīng)對有限的營養(yǎng)環(huán)境，C.difficile會產(chǎn)生針對腸上皮細(xì)胞的毒素，導(dǎo)致腸道屏障的完整性破壞，使宿主暴露于腸道微生物中從而誘發(fā)宿主炎癥反應(yīng)。一項(xiàng)多中心研究表明，在小鼠CDI模型中，毒素B是介導(dǎo)腸上皮損傷、炎癥和死亡的主要毒力因子，而毒素A在介導(dǎo)小鼠炎癥中是相對次要的毒力因子。腸道膽汁酸既能在C.difficile芽孢萌發(fā)和菌體生長中發(fā)揮作用，也可直接結(jié)合和抑制C.difficile的主要毒力因子毒素B，次級膽汁酸相較于相應(yīng)的初級膽汁酸有更強(qiáng)的毒素結(jié)合能力。膽汁酸結(jié)合會導(dǎo)致毒素B構(gòu)象發(fā)生改變，從而阻

9、止毒素B與腸上皮細(xì)胞表面受體結(jié)合或被腸上皮細(xì)胞攝取，進(jìn)而減輕毒素B導(dǎo)致的腸上皮細(xì)胞損傷。此外，牛磺膽酸能夠抑制毒素B和毒素A在上皮細(xì)胞中的毒性作用，但并不會影響C.difficile的菌體生長和總毒素產(chǎn)生；去氧膽酸主要通過抑制毒素B表達(dá)調(diào)節(jié)營養(yǎng)體生長條件下的毒素產(chǎn)生，同樣石膽酸、熊去氧膽酸、豬去氧膽酸等次級膽汁酸也均對多株臨床C.difficile分離株的毒素活性具有抑制作用(圖2)。二、膽汁酸在腸道炎癥和免疫調(diào)節(jié)中的作用Cdifficile與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用是CDI發(fā)病機(jī)制和病原體清除的關(guān)鍵，且已有研究表明宿主因子在CDI的免疫病理學(xué)中發(fā)揮重要作用。次級膽汁酸作為一種強(qiáng)有力的核受體配體

10、，能與法尼酯X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)、維生素D受體和孕烷X受體結(jié)合，還可作為G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5(G protein-coupled bile acid receptor 5，TGR5)的內(nèi)源性激動劑，在機(jī)體營養(yǎng)代謝和天然免疫中發(fā)揮重要的穩(wěn)態(tài)功能(圖2)。FXR是一種在胃腸道和肝組織中表達(dá)的核受體，能夠調(diào)節(jié)膽汁酸穩(wěn)態(tài)。在體內(nèi)，鵝去氧膽酸是FXR最有效的內(nèi)源性配體，去氧膽酸和石膽酸也可作為FXR溫和的激動劑。葡聚糖硫酸鈉或三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的結(jié)腸炎FXR缺陷小鼠主要表現(xiàn)為促炎細(xì)胞因子和促纖維化細(xì)胞因子大量產(chǎn)生，包括腫瘤壞死因子-(tumor necrosis f

11、actor-，TNF-)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1、干擾素、轉(zhuǎn)化生長因子-1和1型膠原，但使用有效的合成配體奧貝膽酸(INT-747)激活FXR后可以防止腸道炎癥的進(jìn)展。TGR5主要表達(dá)于單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上，單核巨噬細(xì)胞可以分泌多種炎癥介質(zhì)，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。去氧膽酸和石膽酸是TGR5最有效的天然膽汁酸配體，對結(jié)腸炎小鼠模型具有保護(hù)作用，能夠抑制促炎因子TNF-和IL-17的產(chǎn)生，減輕腸道炎癥程度，而這種保護(hù)作用在TGR5缺陷小鼠模型中消失。此外，BAR501作為TGR5的選擇性激動劑，能夠使腸道巨噬細(xì)胞從M1型極化為M2型，從而保護(hù)小鼠免受結(jié)腸炎侵襲，由此

12、可見，M2型巨噬細(xì)胞在腸道微環(huán)境中積聚似乎是恢復(fù)腸道組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。綜上所述，腸道菌群-膽汁酸-FXR/TGR5軸在調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)中發(fā)揮明顯作用，也再次證明了次級膽汁酸作為CDI新療法的潛在價(jià)值。三、依賴膽汁酸治療CDI的方法1靶向菌群：膽汁酸作為宿主與腸道菌群溝通的重要信號分子，由宿主合成，并由腸道微生物進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化。膽汁酸的轉(zhuǎn)化主要由腸道微生物產(chǎn)生的2種關(guān)鍵酶參與完成：一種是膽鹽水解酶，能夠水解結(jié)合膽汁酸中的甘氨酸或牛磺酸基團(tuán)；另一種是7-脫羥基酶，能夠?qū)⑽唇Y(jié)合的初級膽汁酸轉(zhuǎn)變成次級膽汁酸。已有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)抗生素干預(yù)后，腸道菌群和膽汁酸代謝組的改變會導(dǎo)致腸道對

13、C.difficile的定植抗性喪失，使得具有調(diào)節(jié)腸道膽汁酸譜能力的腸道菌群得以恢復(fù)，特別是其產(chǎn)生次級膽汁酸，可能對CDI的治療有益。辛氏梭菌屬(Clostridium scindens)主要來自梭狀芽孢桿菌簇a、和，已被證實(shí)具有較強(qiáng)的7-脫羥基酶的活性，該酶由膽汁酸誘導(dǎo)的操縱子編碼。腸道膽酸會誘導(dǎo)辛氏梭菌屬膽汁酸誘導(dǎo)的操縱子表達(dá)增加，導(dǎo)致次級膽汁酸去氧膽酸的產(chǎn)生增加，從而抑制C.difficile芽孢萌發(fā)、菌體生長和毒素產(chǎn)生。益生菌作為治療CDI的一種替代方法，是一種極具潛力的替代抗生素的療法。多形擬桿菌屬(Bacteroides thetaiotaomicron)已被證明對C.diffic

14、ile具有抑制作用，能夠改善膽汁酸譜，使小鼠模型中-鼠膽酸、-鼠膽酸和去氧膽酸增加，從而減弱C.difficile的定植并抑制結(jié)腸內(nèi)炎癥。多形擬桿菌屬還可以通過增強(qiáng)腸道黏膜屏障功能防止病原體入侵，顯著減緩結(jié)腸炎進(jìn)展，并恢復(fù)動物腸系膜淋巴結(jié)輔助性T淋巴細(xì)胞1/輔助性T淋巴細(xì)胞2與輔助性T淋巴細(xì)胞17/調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的平衡，同時促進(jìn)抗炎因子IL-10分泌，抑制促炎因子干擾素和IL-17分泌。雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)益生菌可分泌膽鹽水解酶和羥基類固醇脫氫酶2種酶，在防止C.difficile定植中也起著重要作用。在嬰幼兒自身防御系統(tǒng)不成熟的脆弱時期，雙歧桿菌屬可通過防止病原體在

15、腸道上皮黏附，從而對宿主起保護(hù)作用；在C.difficile相關(guān)性腹瀉患者中，雙歧桿菌屬還可以有效地防止抗生素治療后C.difficile的增殖。值得關(guān)注的是，最新研究表明臭菌科(Odoribacteraceae)的多個菌株能夠在體內(nèi)外誘導(dǎo)isoalloLCA(一種石膽酸衍生物)的產(chǎn)生。isoalloLCA對包括C.difficile和屎腸球菌在內(nèi)的革蘭氏陽性多重耐藥病原菌具有很強(qiáng)的抗菌活性(圖2)。5-還原酶和3-羥基類固醇脫氫酶作為產(chǎn)生isoalloLCA的關(guān)鍵酶，在臭菌科中具有較高的活性。給予小鼠CDI模型外源性臭菌科菌株后，小鼠糞便中isoalloLCA水平顯著增高，從而維持腸道內(nèi)環(huán)境

16、穩(wěn)態(tài)。此外，Koopen等研究發(fā)現(xiàn)另一種含有編碼膽汁酸-鈉同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(EHLA-2286)和膽鹽水解酶(EHLA-1602和EHLA-2245)基因的革蘭氏陽性厭氧菌Anaerobutyricum soehngeniiL2-7(A.soehngeniiL2-7)，并發(fā)現(xiàn)在給代謝綜合征患者腸內(nèi)補(bǔ)充A.soehngeniiL2-7后，?；蛆Z去氧膽酸、?；鞘懰帷⒏拾比パ跄懰岷托苋パ跄懰岬却渭壞懼岬乃斤@著提高，同時與膽汁酸代謝/運(yùn)輸相關(guān)基因的表達(dá)增加，從而改善血糖水平，這一機(jī)制可能與膽汁酸作用于TGR5相關(guān)。目前尚未見相關(guān)研究證明A.soehngeniiL2-7可直接影響CDI，未來還需進(jìn)一步

17、發(fā)掘該菌治療CDI的潛力。故通過調(diào)整腸道菌群的組成來恢復(fù)宿主免疫穩(wěn)態(tài)，可能成為未來治療腸道相關(guān)疾病的有效方法。2多酚類化合物：腸道健康很大程度上受飲食影響，食物為宿主和腸道菌群提供底物，調(diào)節(jié)腸道菌群的組成，腸道菌群的改變又會進(jìn)一步影響膽汁酸代謝，進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道免疫屏障功能。茶是全球第二大最常飲用的飲料，酚類物質(zhì)約占茶葉干重的30%，尤其是兒茶素和沒食子酸，該茶酚類物質(zhì)能夠顯著抑制C.difficile菌體生長。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)是綠茶中含量最豐富的多酚類兒茶素，具有抗菌、抗炎和抗氧化等多種生物學(xué)功能。研究表明，口服EGCG能夠顯

18、著增加腸道擬桿菌門的豐度，并通過增加肝臟氧固醇7羥化酶1的表達(dá)使膽汁酸合成途徑由經(jīng)典途徑轉(zhuǎn)變成替代途徑，從而導(dǎo)致-鼠膽酸、鵝去氧膽酸和牛磺石膽酸增加；并且給予小鼠高脂飲食模型EGCG后，疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)尤其是阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)的豐度顯著增加，該改變主要通過激活TGR5途徑實(shí)現(xiàn)，這些結(jié)果表明EGCG在改變腸道菌群和膽汁酸合成途徑方面發(fā)揮了突出作用。此外，預(yù)防性服用EGCG可顯著改善健康小鼠腸道的抗炎狀態(tài)和抗氧化狀態(tài)，表明EGCG具有改善腸道屏障的潛力和治療CDI的潛在價(jià)值。多酚類化合物茶褐素在調(diào)節(jié)腸道菌群和膽汁酸代謝方面也顯示出絕對