血清白蛋白的分離純化及鑒定(一)-鹽析、G-25脫鹽、G-75層析課件

1、血清白蛋白分離與純化實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解血清蛋白質(zhì)分離的一般方法2.掌握鹽析法、凝膠層析分離純化白蛋白的方法實(shí)驗(yàn)原理血清中主要蛋白：白蛋白與球蛋白正常人血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白的量保持相對(duì)恒定；總蛋白60-80克/升，白蛋白為40-50克/升，球蛋白為20-30克/升。 鹽析法中性鹽類能破壞溶液中蛋白分子表面的雙電子層和水膜，從而使蛋白質(zhì)從溶液中凝聚沉淀析出。利用白蛋白和球蛋白在高濃度中性鹽溶液中(常用硫酸銨)溶解度的差異而進(jìn)行沉淀分離，此為鹽析法。血清白蛋白在飽和硫酸銨溶液中沉淀析出，血清球蛋白在半飽和硫酸銨溶液中沉淀析出。凝膠層析1、凝膠層析也稱凝膠過濾，是一類利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠

2、的層析技術(shù)，是一種分子篩效應(yīng)。2、當(dāng)樣品流經(jīng)這類凝膠的固定相時(shí)，不同分子大小的各組分因進(jìn)入網(wǎng)孔受阻滯的程度不同而以不同的速度通過層析柱，從而達(dá)到分離的目的。凝膠類型分離范圍（Mr）應(yīng)用G-251000-5000去鹽G-753000-70000中等蛋白質(zhì)分離不同類型的葡聚糖凝膠的分離范圍和應(yīng)用實(shí)驗(yàn)步驟-硫酸銨鹽析取正常人血清2.0ml于小試管中，邊搖邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液2.0ml，混勻后于室溫中放置10min，3000rmin離心10min。用滴管小心吸出上層清液于另一試管中，作為純化白蛋白之用。凝膠柱G-25層析除鹽3、洗脫：凝膠柱經(jīng)0.02 mol/L PH6.5 NH4Ac緩沖液平衡后

3、，慢慢打開底口使凝膠床上的液面下降到與床面相齊（不低于凝膠床面），夾死底口。用吸管吸取樣品，小心緩慢的加到凝膠床面，打開底口，使樣品慢慢進(jìn)入凝膠床面直至與床面相齊。吸取緩沖液，沿壁慢慢加入凝膠床面，進(jìn)行洗脫。4、收集：洗脫液用部分收集器收集（或者手工操作），每管2ml，用紫外檢測儀檢測蛋白峰并收集，為樣品，繪制洗脫曲線。凝膠柱G-75分離純化1、裝柱：洗凈的層析柱垂直夾于鐵架上（有尼龍網(wǎng)孔的一頭朝下），將底部夾緊，注入約2.0 ml的0.02 mol/L PH6.5 NH4Ac緩沖液。將G-75疑膠攪成懸浮狀加入層析柱內(nèi)，慢慢打開柱底部出口，同時(shí)，不斷加入凝膠直至柱高25cm（裝柱時(shí)速度要均勻

4、，不能分層，不得有氣泡，凝膠床表面要平整）。2、平衡：在凝膠柱床上留有3cm高的溶液，將層析柱底部旋緊，用0.02 mol/L PH6.5 NH4Ac緩沖液平衡20min，(防止柱床流干)。凝膠柱G-75分離純化3、洗脫：凝膠柱經(jīng)0.02 mol/L PH6.5 NH4Ac緩沖液平衡后，慢慢打開底口使凝膠床上的液面下降到與床面相齊（不低于凝膠床面），夾死底口。用吸管吸取樣品，小心緩慢的加到凝膠床面，打開底口，使樣品慢慢進(jìn)入凝膠床面直至與床面相齊。吸取緩沖液，沿壁慢慢加入凝膠床面，進(jìn)行洗脫。4、收集：洗脫液用部分收集器收集（或者手工操作），每管2ml，用紫外檢測儀檢測蛋白峰并收集，為樣品，繪制洗

5、脫曲線。紫外檢測儀的使用量程范圍：0-100%T、0-2A、0-1A、0-0.5A、0-0.2A、0-0.1A、0-0.05A紫外檢測儀主要技術(shù)指標(biāo)： 1、調(diào)節(jié)光量旋鈕，量程旋鈕放置100%T檔，使LED數(shù)字顯示為100，T撥到A檔，使LED面板上讀數(shù)為0左右，若作透光度T測試，就可在層析柱上加樣，對(duì)樣品進(jìn)行分離分析。 2、若做光密度A測試，把量程旋鈕（即靈敏度）撥到所需光密度A，調(diào)節(jié)光量旋鈕，使LED面板為0。此時(shí)記錄儀回到零點(diǎn)附近（注：零點(diǎn)附近即可，在實(shí)驗(yàn)中可自來定）。 3、如繪出圖譜峰值過小，把量程旋鈕（即敏度）撥到所需位置。 4、在測試過程中，“光量”均不再變動(dòng)。測試完畢，并用蒸餾水清洗樣品池和管道。紫外檢測儀記錄儀1、量程一定用10mv。2、走紙速度：G25，2A，5 cm；G75,1A，1-2 cm。紫外檢測儀使用方法：1、首先將