免疫組化幻燈課件

1、 掌握免疫組化技術(shù)的概念、原理、優(yōu)點(diǎn)、ABC染色的基本操作，了解免疫組化染色技術(shù)的其他幾種方法及臨床應(yīng)用。 學(xué)習(xí)重點(diǎn)主要講述的內(nèi)容概述免疫組化的概念和優(yōu)點(diǎn)。免疫組化染色前的準(zhǔn)備。抗體的標(biāo)記如何降低非特異性染色。免疫組織化學(xué)方法免疫組化結(jié)果的判定以及染好切片的關(guān)鍵免疫組織化學(xué)的應(yīng)用。免疫酶組織化學(xué)染色圖片舉例。免疫組織化學(xué)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，其主要原理是用熒光素、生物素或地高辛等標(biāo)記的抗體（或抗原）對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）進(jìn)行定性、定位或定量檢測，經(jīng)過組織化學(xué)的呈色反應(yīng)之后，用顯微鏡、熒光顯微鏡或電子顯微鏡觀察。凡是能作抗原、半抗原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受體

2、及病原體等都可應(yīng)用相應(yīng)的特異性抗體，將其用免疫細(xì)胞化學(xué)手段檢出，并研究。概念2. 敏感性高現(xiàn)代免疫細(xì)胞化學(xué)采用各種有效方法最大限度保存細(xì)胞和組織內(nèi)待檢物質(zhì)的抗原性，采用各種增敏方法，使用高度敏感的和高親和力的抗體，保證可檢出細(xì)胞內(nèi)超微量的抗原分子，用顯微鏡和電子顯微鏡觀察結(jié)果，因此，它是在細(xì)胞、分子水平或基因水平的檢測技術(shù)。3. 方法步驟統(tǒng)一若掌握一種技術(shù)操作方法步驟，則一通百通。4. 形態(tài)、機(jī)能和代謝密切結(jié)合是一種集定性、定位和定量密切結(jié)合；形態(tài)、機(jī)能和代謝密切結(jié)合為一體的研究和檢測技術(shù)?？乖迯?fù) 常規(guī)石蠟切片的標(biāo)本一般均采用甲醛固定，甲醛固定的部分組織細(xì)胞免疫組化的敏感性明顯降低，主要原因

3、為甲醛固定過程中形成的醛鍵以及甲醛固定導(dǎo)致的蛋白與蛋白之間的交聯(lián)，均會(huì)封閉部分抗原決定簇，同時(shí)甲醛的這種交聯(lián)作用會(huì)影響細(xì)胞膜的通透性，使抗體分子難于滲入細(xì)胞內(nèi)，從而影響染色效果?；瘜W(xué)方法(酶消化方法) 胰蛋白酶(trypsin)消化方法 酶濃度一般為0.05%0.1%, 胃蛋白酶(pepsin消化方法 0.4%胃蛋白酶 鏈霉蛋白酶(poruse)消化方法 濃度為0.1%。微波方法將切片常規(guī)脫臘后水洗，放入盛有枸櫞酸緩沖液的容器中，置微波爐加熱沸騰，時(shí)間為5min2次。加熱完畢，將切片缸在室溫下放置，使缸內(nèi)溫度自然下降至40左右，蒸餾水洗，進(jìn)入免疫組化染色。 免疫組化染色中比較成熟的標(biāo)記物有：異

4、硫氰酸熒光素、辣根過氧化物酶、鐵蛋白、膠體金、葡萄球菌A蛋白、生物素、放射形核素等。 由于標(biāo)記物和抗體結(jié)合，酶促反應(yīng)的定位就間接地顯示抗原-抗體反應(yīng)的定位。在滴加一抗前，采用非免疫動(dòng)物血清封閉組織中的帶電集團(tuán)，避免與第一抗體的非特異性結(jié)合。阻斷內(nèi)源性酶。如3%的H2O2等。增加第一抗體的稀釋度調(diào)整孵育時(shí)間及反應(yīng)溫度避免染色過程中標(biāo)本干枯等方法。免疫酶組織化學(xué)消除非特異性染色的幾種方法免疫組化染色方法(1)免疫熒光法(2)免疫酶標(biāo)法(3)免疫膠體金法免疫熒光法的基本原理將已知的抗體分子標(biāo)記上熒光素，再與相應(yīng)的抗原起反應(yīng)，形成的抗原抗體復(fù)合物因帶有熒光素，在熒光顯微鏡下可以觀察到發(fā)出熒光的免疫復(fù)合

5、物結(jié)合部位，從而做出判斷。 作為病理診斷，免疫熒光法具一些不足之處,如：(1)特異性抗體用量大；(2)敏感性及特異性不夠理想；(3)熒光強(qiáng)度隨時(shí)間延長而慢慢減弱；(4)需要昂貴的特殊顯微鏡。免疫酶組織化學(xué)方法60年代日本學(xué)者Nakane等首創(chuàng)建立了酶標(biāo)記抗體技術(shù)檢測組織中的抗原，免疫酶組織化學(xué)技術(shù)的特點(diǎn)：可用普通顯微鏡代替熒光顯微鏡；切片不易褪色，可長期保存；陽性細(xì)胞定位精確；組織結(jié)構(gòu)清晰；可作免疫電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察等優(yōu)點(diǎn)。標(biāo)記抗體法不標(biāo)記抗體法常用的免疫酶組織化學(xué)方法免疫酶組織化學(xué)常用的酶辣根過氧化物酶（HRP）穩(wěn)定性好，在PH3.512范圍, 60加熱15分鐘不失活穿透性強(qiáng)，溶解度大.底物為

6、H2O2，DAB（3，3-二氨基聯(lián)苯胺）為供氫體,反應(yīng)式為：HRP. H2O2 +DH2 HRP+D+2H2O堿性磷酸酶（AP）ABC三步法(親和素-生物素-過氧化物酶連結(jié)法) ABC法是利用親和素（卵白素）與生物素特有的高度親和力這一生物學(xué)性質(zhì),先將生物素與辣根過氧化酶（HRP）結(jié)合，形成生物素化HRP(B液)，然后與親和素(A液)按一定的比例混合，形成ABC復(fù)合物。用生物素化的二抗與一抗結(jié)合，再與ABC復(fù)合物結(jié)合，最后用底物顯色劑顯色。ABC 復(fù)合物ABC 法優(yōu)點(diǎn)：敏感性高，約為PAP法的8-40倍；特異性強(qiáng)，非特異性背景著色低；方法簡便，應(yīng)用范圍廣。步驟 直接滴加第一抗體； PBS沖洗；

7、 滴加生物素化的二抗； PBS沖洗； 滴加ABC復(fù)合物； PBS沖洗； DAB顯色。 SP法或LSAB、SABC法(鏈親和素-過氧化物酶連結(jié)法) 用鏈親和素（SA）代替ABC復(fù)合物中的卵白素蛋白（親和素）即形成SP法。染色原理同ABC法。 LSAB法中由于采用鏈親和素，避免了與組織中內(nèi)源性生物素結(jié)合的可能，所以背景染色低、放大效果高。其標(biāo)記技術(shù)比PAP、ABC法更為簡便、敏感、特異，且價(jià)格較低而在我國逐漸普及。IGS法(免疫金法)： 用金標(biāo)記代替酶標(biāo)記。 IGS的基本原理是先用特異性抗體與抗原反應(yīng)，隨后用金標(biāo)記的間接抗體或A蛋白再與特異性抗體結(jié)合，再用乳酸銀處理，銀顆粒沉積在金顆粒上，還原銀顯

8、示為黑褐色。免疫組織化學(xué)的應(yīng)用(一)提高病理診斷的準(zhǔn)確性病理診斷當(dāng)屬堅(jiān)信不疑的，但在實(shí)際工作中要做到100%是不可能的。采用免疫組化檢查后，部分疑難病例最后獲得正確診斷。應(yīng)用免疫組化方法，可以大大提高病理診斷的準(zhǔn)確率，有利于疾病的臨床診治。1、激素受體及生長因子的檢測在預(yù)后及治療方面的應(yīng)用激素受體和各種生長因子對(duì)正常組織的功能調(diào)節(jié)是必不可少的，同時(shí)也可影響著腫瘤的生物學(xué)行為。應(yīng)用免疫組化方法，可對(duì)腫瘤內(nèi)各種激素受體與生長因子進(jìn)行定位、定量分析，這已廣泛應(yīng)用于腫瘤臨床工作。(二)在腫瘤病理學(xué)的研究和診斷中的應(yīng)用如對(duì)乳腺癌與激素受體關(guān)系的研究已有了較明確的結(jié)論，即雌激素受體陽性的乳腺癌患者預(yù)后優(yōu)于

9、陰性者，而且陽性者對(duì)內(nèi)分泌治療反應(yīng)好、無瘤生存期延長。相似的結(jié)果也見于子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌。2、癌基因蛋白表達(dá)的臨床及預(yù)后方面的研究應(yīng)用對(duì)癌基因(oncogenes)在腫瘤生物學(xué)中的價(jià)值已有大量的研究，用免疫組化的方法可對(duì)這些癌基因蛋白進(jìn)行定位和定量的檢測，以探討其臨床意義。雖然癌基因的種類繁多，但目前已有腫瘤臨床意義的卻十分有限，主要是c-erbB-2、c-myc、ras和p53。在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)表達(dá)cerbB-2的浸潤性乳腺癌患者預(yù)后差。惡性度高者陽性率高。在卵巢癌中陽性率為30%，而且提示，陽性表達(dá)的卵巢癌者預(yù)后要差。c-myc是作用于核內(nèi)DNA的癌基因，可剌激DNA的合成。c-myc

10、的過度表達(dá)則促進(jìn)腫瘤的生長和發(fā)展，因而腫瘤的侵襲性增加。在對(duì)宮頸癌、小細(xì)胞肺癌的研究中已證實(shí)，c-myc表達(dá)增加者存活期縮短。p21是一種ras癌基因蛋白，己發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌、大腸癌中表達(dá)增高，在卵巢癌亦有過度表達(dá)的報(bào)道。對(duì)于其預(yù)后意義則仍有一些不同的看法。3、對(duì)腫瘤細(xì)胞增生程度的評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞增生是否活躍直接影響著臨床治療與預(yù)后。判斷一個(gè)腫瘤是否生長活躍方法較多，有核仁組成區(qū)嗜銀蛋白(AgNOR)的染色、3H-胸腺嘧啶攝入放射自顯影、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)等，但實(shí)踐證明其中以免疫組化法對(duì)瘤細(xì)胞增生抗原進(jìn)行定位定量最為簡便、可靠，主要是通過Ki-67和PCNA(prolifer-ation cell

11、 nuclear antigen)的單克隆抗體來實(shí)現(xiàn)的。4、發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶用常規(guī)病理組織學(xué)方法要在一個(gè)組織中認(rèn)出單個(gè)轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞或幾個(gè)細(xì)胞是不可能的，而采用免疫組化方法則十分有助于微小轉(zhuǎn)移灶的發(fā)現(xiàn)。5、在腫瘤分期上的意義在判斷腫瘤是原位還是有浸潤發(fā)生以及有無血管、淋巴管的侵襲是與腫瘤分期密切相關(guān)的。采用免疫組化法檢查可獲得明確的結(jié)果。如采用層粘連蛋白(laminin）和型膠原的單克隆抗體可以清楚地顯示基底膜的主要成分。一旦證實(shí)上皮性癌突破了基底膜，就不是原位癌，而是浸潤性癌了，其預(yù)后意義是不同的。6、指導(dǎo)腫瘤的治療應(yīng)用免疫組化的檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在腫瘤的治療上也有應(yīng)用前景。如許多腫瘤對(duì)化療不敏感，是由于瘤細(xì)胞內(nèi)多藥耐藥基因(multidrug resistant gene)編碼的酶的活性增加所致。如二氫葉酸還原酶以及P-糖蛋白增加，用免疫組化方法可以檢查細(xì)胞內(nèi)的這些酶或糖蛋白，以了解腫瘤是否有抗藥性。7、在腫瘤病理學(xué)的研究和診斷中的其他應(yīng)用組織起源不明腫瘤的判斷。研究病原體與腫瘤的關(guān)系協(xié)助確定腫瘤的良惡性分化差的癌和肉瘤的鑒別：CK、Vimentin、LCA、S-100等。確定原發(fā)病灶PSA陽性-前列腺癌轉(zhuǎn)移甲狀腺球