一種肽類激素及其受體蛋白激酶調(diào)控植物細(xì)胞擴(kuò)增

1、一種肽類激素及其受體蛋白激酶對(duì)植物細(xì)胞擴(kuò)增的調(diào)控作用植物細(xì)胞是不動(dòng)的；因此，植物的生長發(fā)育依賴于細(xì)胞的擴(kuò)增，而不是細(xì)胞遷移。通過 該質(zhì)膜引發(fā)細(xì)胞擴(kuò)增率變化的分子機(jī)制仍不清楚。我們發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中，(1)一種分泌肽 RALF(快速堿化因子)，通過激活細(xì)胞表面受體FERONIA抑制了初生根的細(xì)胞伸長RALF 和 FERONIA 特異性結(jié)合直接證明了肽受體間的相互作用，減少固定的和不敏感的 RALF 受體會(huì)抑制 FERONIA 突變體的生長。磷酸化蛋白質(zhì)的測(cè)量表明，(2)該 RALF-FERONIA 相互作用導(dǎo)致質(zhì)膜H+-腺苷三磷酸酶2在Ser899磷酸化，并參與抑制質(zhì)子的運(yùn)輸。本結(jié)果 揭示了 RA

2、LF誘導(dǎo)的胞外堿性化和信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞擴(kuò)展分子機(jī)制。細(xì)胞擴(kuò)增是一個(gè)基本的細(xì)胞過程驅(qū)動(dòng)的植物生長，并且在其生長過程中其速度和方向的 調(diào)節(jié)是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)變化的過程，并借此適應(yīng)外部環(huán)境的變化。維持合適的細(xì)胞膨脹速率， 植物細(xì)胞微調(diào)涉及由蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化蛋白質(zhì)磷酸化級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。植物細(xì)胞 微調(diào)涉及由蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化蛋白質(zhì)磷酸化級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來維持合適的細(xì)胞 膨脹速率。例如，光，生長刺激素生長素增加細(xì)胞擴(kuò)增率，并在質(zhì)膜H +-ATP酶(H+-ATP 酶)的C-末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，通過磷酸化的倒數(shù)第二Thr947殘基的減少質(zhì)外體的pH值。(3)RALF (快速堿化因子)，一種5- K

3、D的分泌肽首次發(fā)現(xiàn)，并分析尋找植物內(nèi)源肽， 增加培養(yǎng)細(xì)胞介質(zhì)的pH值，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞胞漿鈣的快速增加。在擬南芥基因組中RALF類 基因超過30種，根中RALF最高度表達(dá)應(yīng)該是參與根發(fā)育。我們?cè)谶@里報(bào)告的信號(hào)過程涉及 質(zhì)膜上肽-受體相互作用抑制根細(xì)胞伸長oRALF調(diào)用鈣的方式類似的動(dòng)物肽生長因子的信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其中所述因子結(jié)合到細(xì)胞表面受體則自動(dòng)進(jìn)行磷酸化。我們證明了FERONIA 類受體激酶結(jié)合RALF，并啟動(dòng)下游的磷酸化信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)并抑制血漿質(zhì)膜H+-ATPase舌性, 提高質(zhì)外體pH值，并減少細(xì)胞伸長。我們確定RALF和FERONIA作為配體-受體對(duì)，并提供 的分子機(jī)制的FERONIA介導(dǎo)

4、的生長抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，這可能是相交的先天免疫響應(yīng)途 經(jīng)。圖1，RALF誘導(dǎo)后FERONIA受體激酶磷酸化的增加趨勢(shì)。質(zhì)譜圖顯示，經(jīng)RALF處理后，含pS871和pS874的FERONIA磷酸肽大量增加。提取F ERONIA磷酸化離子色譜圖表明RALF誘導(dǎo)會(huì)增加Ser858磷酸化。FERONIA受體激酶的結(jié)構(gòu)。SP，信號(hào)肽;TM,跨膜結(jié)構(gòu)域;JM,近膜結(jié)構(gòu)域;KD,激 酶結(jié)構(gòu)域。箭頭指示的是FER突變體的T-DNA插入的位置。氨基酸的縮寫：A,丙氨酸;D, ASP; E,谷氨酸;F，苯丙氨酸，G,甘氨酸，我，法蘭西島大區(qū)，K,賴氨酸，L,亮氨酸， M#, oxidizedMet, N,天冬酰胺

5、，P,親，Q,谷氨酰胺，R,精氨酸，S,絲氨酸，T,蘇 氨酸，V，纈氨酸，Y,酪氨酸;秒，磷酸化絲氨酸。在生化和遺傳的研究中為了獲得材料，我們將RALF作為N-末端6xHis融合肽在用親 和柱和反相高性能液相色譜法純化一致的大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。具有標(biāo)簽的 RALF 在細(xì)胞 質(zhì)鈣動(dòng)員時(shí)具有生物活性。作為陰性對(duì)照，我們也生產(chǎn)和純化非活性RALF類似體，RALF （D2-8）,在其N末端缺少7個(gè)氨基酸并且是無生物活性的類似物。為了檢驗(yàn)RALF誘導(dǎo)質(zhì) 膜蛋白的迅速磷酸化變化，我們采用一個(gè)15N代謝標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行質(zhì)譜磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)定量 分析，幼苗用1 um的RALF肽（水處理為對(duì)照）處理5分鐘，然后混勻

6、，并純化質(zhì)膜。用 于生物重復(fù)的，則樣品標(biāo)記為往復(fù)。質(zhì)譜分析磷酸允許量化 550 14N/15N 磷酸對(duì)， A （i4NRALF/i5Ncontrol）和 B （i4Ncontrol/i5NRALF）的圍繞中位數(shù) 1.14 和 1.17 變化，磷素 定量測(cè)定中，五種蛋白的豐度發(fā)生變化，通過反復(fù)的觀察，這個(gè)變化至少有2.倍。這些蛋白 質(zhì)中的四種蛋白豐度都增加FERONIA受體激酶（pS871和pS874, 8.3至13.4因素，圖1A； 質(zhì)膜H+-ATP酶2（AHA2;系數(shù)為2.64.3，無花果。S8）；鈣依賴蛋白激酶9 （CPK9;系 數(shù)為4.012.1,圖S9）；和PEN3/ABCG36轉(zhuǎn)運(yùn)體

7、（4.17因子.52）,和其中一種蛋白質(zhì)豐度 下降:這種蛋白是我們長期猜測(cè)的有關(guān)FERONIA類受體激酶（ERU;系數(shù)為0.22,圖S10A）； 和 PEN3/ABCG36 轉(zhuǎn)運(yùn)（4.17 因子 4.52）。我們還觀察到包含絲氨酸磷酸化位點(diǎn)（pS858）的FERONIA磷酸化豐度的大量增加。 在液相色譜-質(zhì)譜分析過程中受到無關(guān)的共洗脫肽阻礙，但我們重建FERONIA磷酸化色 譜圖，SSDVYEGNVTDsR （圖1B）。該pS858磷酸在RALF處理的組織增加了約20倍。使 用選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)含有pS858 （fig.S7, C和D）的同位素標(biāo)記的合成磷酸肽，我們確定在 RALF處理的秧苗中pS

8、858是增加了 6.4-11.5倍。通過類比哺乳動(dòng)物表皮生長因子受體磷酸 化調(diào)節(jié)過程，我們推測(cè)FERONIA是RALF受體，C端的磷酸化激活蛋白激酶和引起RALF 誘導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)（圖 1C）。該FERONIA受體類似激酶在花粉管伸長受阻的擬南芥突變體重第一次被發(fā)現(xiàn)。在正常 的施肥，在花粉管停止伸長并釋放其精子到細(xì)胞核，而在FER突變體中，花粉管消長和無 法釋放精子到細(xì)胞核，從而降低生育能力。FERONIA是malectin受體激酶家族的最廣泛表 達(dá)成員之一。除了改變FERONIA,我們檢測(cè)到的malectin受體家族中另一個(gè)RALF的受體， 在這種情況下，在豐富的含磷酸 pS497 位于近

9、膜結(jié)構(gòu)域下降的另一個(gè)成員。為了測(cè)試這兩 種受體激酶（FERONIA和ERULUS）在植物體中依賴RALF進(jìn)行磷酸化的功能，我們比較了敲除FER5和敲除FER4與野生型在RALF的存在和不存在時(shí)的轉(zhuǎn)移DNA （T-DNA）的生長。在1 m mol RALF，野生型生長受到抑制，而fer4無效突變體對(duì)RALF 是不敏感的，敲出FER5的突變體屬于受抑制程度適中（Fig.2A）。與此相反，ERULUS的 T-DNA的突變體顯示出較短的根毛，但相對(duì)于野生型，景觀有響應(yīng)RALF并改變其磷酸化 的，也有對(duì)RALF敏感性不顯著的（圖2B）。RALF處理后抑制野生型根伸長的原因是由 于細(xì)胞的伸長減少所致。為表

10、征RALF處理后的幾秒鐘內(nèi)發(fā)生RALF誘導(dǎo)早期細(xì)胞應(yīng)答，我們使用表達(dá)擬南芥 幼苗水母發(fā)光蛋白作為胞質(zhì)鈣受體，檢測(cè)FER4突變體的胞內(nèi)鈣變化。經(jīng)RALF誘導(dǎo)后，野 生型觀察到鈣增加，而FER4突變株缺沒有出現(xiàn)（圖2C）,但采用ATP控制處理對(duì)照實(shí)驗(yàn)表 明，該突變體fer4充分響應(yīng)此鈣動(dòng)員激動(dòng)劑，因而不是通常有缺陷的鈣響應(yīng)阻礙（圖12）。 這些結(jié)果表明，該FER4突變體是特異性缺乏在依賴RALF鈣信號(hào)系統(tǒng)。RALF 和 FERONIA 在苗期根的成熟區(qū)都高度表達(dá)，以及它們的 mRNA 表達(dá)模式和 RALF誘導(dǎo)的根生長抑制表明，這兩種蛋白在伸長區(qū)限制細(xì)胞的伸長存在共同作用。與此相 一致的想法， RA

11、LF 處理 30 分鐘后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)：已知參與編碼細(xì)胞膨脹的基因 SAUR63， expansin， BR6OX2 和 Gibberellin-3-Oxidase 1 的生物合成都是下調(diào)。經(jīng) RALF 處理后，鈣和乙烯信號(hào)，包括鈣調(diào)素和乙烯響應(yīng)因子相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)。 RALF 誘導(dǎo) BR6OX2表達(dá)的變化在FER4突變體中是不存在的。來源于致病菌鞭毛的肽flg22被受體FLS2檢測(cè)，并誘導(dǎo)了 Ser899上AHA2的磷酸化， 該磷酸化與質(zhì)外體堿化同步進(jìn)行。一個(gè)AHA2 S899D（Ser899 -Asp）突變體在酵母菌中表 達(dá)證明這個(gè)單擬磷酸突變相對(duì)于野生型AHA2增長減少；因此，RA

12、LF處理后，預(yù)測(cè)Ser899 中AHA2磷酸化增長使得H+-ATPase功能下降，這為觀測(cè)到的RELF引起的質(zhì)外體堿化提 供了分子層面的解釋。在對(duì)RALF-FERONIA反應(yīng)特異性的檢測(cè)后，我們測(cè)到fer突變體中 flg22靈敏度以及fls2突變體中RALF靈敏度。Fer4突變體對(duì)RALF不敏感但對(duì)肽flg22敏 感，并且fls2突變體對(duì)flg22不敏感，但對(duì)RALF敏感。我們認(rèn)為激酶和細(xì)胞表面受體以及 與RALF發(fā)射信號(hào)相關(guān)的蛋白質(zhì)（與RAL協(xié)同調(diào)節(jié)或在處理過后30分鐘被RALF誘導(dǎo)） 挑選了 17 行其他含有基因敲除突變。這些材料在根伸長過程中對(duì) RALF 敏感度與野生型 （Fig.2B）

13、沒有區(qū)別，因此我們可以下結(jié)論，fer4對(duì)RALF的反應(yīng)是特異性的。上述觀察表明，F(xiàn)ERONIA通過抑制AHA2的活性介導(dǎo)RALF對(duì)根伸長的抑制作用，同時(shí) 分泌質(zhì)子到質(zhì)外體。我們的模型預(yù)測(cè)，F(xiàn)ER 4突變體中H +- ATP酶的活性組成上調(diào)，與此預(yù) 測(cè)一樣，實(shí)驗(yàn)測(cè)量表明，F(xiàn)ER4突變體基質(zhì)酸化比野生型更快。此外，抑制劑陽離子鋰存在 時(shí)進(jìn)行根長測(cè)定，F(xiàn)ER4突變根表現(xiàn)出高度敏性，其生長明顯比野生型更差（圏B）這個(gè)響 應(yīng)是一個(gè)典型的突變植物H +-ATP酶活性增加和質(zhì)膜超極化的表型，這會(huì)導(dǎo)致制陽離子進(jìn)入 細(xì)胞質(zhì)。通過藍(lán)色光育苗測(cè)定根H +-ATPase舌性增加的影響，其促進(jìn)根伸長。FER4和RALF

14、 功能缺失突變體的根均長于野生型的(圖 3C)。為了驗(yàn)證 RALF是否結(jié)合 FERONIA，我們?cè)?Nicotiana benthamiana中利用 HisRALF、 HisRALF (D2-8)與血球凝集素(HA)標(biāo)記FERONIA(FER-HA)進(jìn)行免疫共沉淀試驗(yàn)。 FER-HA蛋白質(zhì)的表觀分子質(zhì)量大部分在40 kD，以HisRALF蛋白為8 kD (圖4, A和B)。 His-RALF結(jié)合比非活性類似物高出4.5至6倍。添加時(shí)缺乏HisRALF (D2-8)的影響 當(dāng)加入H isRALF進(jìn)行根抑制試驗(yàn)時(shí)缺少HisRALF(D2-8)的影響，表明HisRALF(D2-8)不能與 RALF受

15、體相互作用(圖4, A和C)。在另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中用25nmol RALF (標(biāo)記呵)，我們測(cè)量 有非放射性的25nmol存在或不存在時(shí)RALF肽與野生型和FER4突變體細(xì)胞膜的結(jié)合情況(圖4D)。約一半的碘化RALF的約束到野生型質(zhì)膜減少非放射性RALF通過過量，顯示該綁 定的區(qū)域不僅是具體而卻還能飽和。在FER4突變體中，飽和結(jié)合區(qū)減少了 40%，但不能 完全消失。我們的觀察在更高的濃度(5mmol)下，根生長抑制試驗(yàn)和胞質(zhì)鈣離子濃度測(cè)定 試驗(yàn)中FER4突變體對(duì)RALF不是完全不敏感，這支持了在野生型質(zhì)膜中除了 FERONIA外還 有其它能結(jié)合RAL F的位點(diǎn)。在體外通過大腸桿菌融合實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證

16、實(shí)RALF和FERONIA直 接和特異的結(jié)合。RALF特異性結(jié)合到GST-ectoFER和HisMBP-ectoFER，無活性的RALF很 少或根本沒有結(jié)合ectoFER蛋白(圖4, E和F)。我們的結(jié)果表明，F(xiàn)ERONIA是受體RFLA和 這個(gè)受體激酶介導(dǎo)我們的結(jié)果表明，F(xiàn)ERONIA是RALF的一種受體，該受體激酶介導(dǎo)擬南芥根系中RALF 抑制細(xì)胞生長率的功能。我證明了RALF是FERONIA的一種天然存在的配體，這個(gè)激酶對(duì)以 后工作中負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞擴(kuò)增具有推動(dòng)作用。圖2, FER功能缺失的突變體對(duì)RALF特別不敏感。幼苗用ImmolRALF處理后，F(xiàn)ER4和FER5植株對(duì)RALF抑制根系生

17、長的敏感性降低。對(duì)RAL F的不敏感的FER突變體是很特殊的。突變體的其他18種類受體蛋白對(duì)RAL F的響 應(yīng)正常。(C)正常FERONIA功能是RALF誘導(dǎo)胞質(zhì)鈣增加所必需的。幼苗用500nmol的 RALF處理。(D)RAL F處理不僅導(dǎo)致野生型BR6OX的表達(dá)下降，在FER4突變體中也一樣。圖3, FER功能缺失突變體顯示植物典型的表型為具有更高的質(zhì)膜H+-ATPase活性。fer4突變體幼苗酸化的的速度比野生型更快。FER4根的生長對(duì)鋰離子脅迫更敏感，這與其具有大量的泵和更低的膜電位保持一致。幼苗在藍(lán)光下生長7天。FER4突變體具有更長的根系。圖4, RALF結(jié)合FERONIA。HisRALF (D2-8)是RALF的無活性類似物，根生長抑制試驗(yàn)中它不與RALF相互競爭。煙草RALF特異性結(jié)合FERONIA蛋白質(zhì)的表現(xiàn)形式。紅色箭