實(shí)驗(yàn)六血糖及血清膽固醇測定

1、一、酶法（GOD-POD）測血清葡萄糖含量第一頁，共三十六頁。實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆掌咸烟茄趸阜y定血糖含量的原理和方法 掌握測定血糖的臨床意義第二頁，共三十六頁。 鄰甲苯胺法 酶法： 血糖的測定方法：準(zhǔn)確度、靈敏度高，穩(wěn)定性好葡萄糖氧化酶-過氧化物酶偶聯(lián)法 （GOD-POD）實(shí)驗(yàn)原理第三頁，共三十六頁。偶聯(lián)酶法測血糖 葡萄糖O2H2O2葡萄糖酸葡萄糖氧化酶（GOD）H2O24-氨基安替比林H2O醌亞胺染料過氧化物酶（POD）紅色第四頁，共三十六頁。 紅色醌亞胺染料在500nm處具有吸收峰 采用標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比法可計(jì)算得到樣品中葡萄糖 濃度 紅色醌亞胺染料的生成量與葡萄糖含量 成正比第五頁，共三十六頁。實(shí)驗(yàn)器

2、材 試管1.55cm（3）、試管架 吸量管2mL（1）、洗耳球 微量加樣器：20l的Pipetman 恒溫水浴箱 離心機(jī)、離心管10ml（2）第六頁，共三十六頁。實(shí)驗(yàn)試劑 葡萄糖測定試劑盒：原裝試劑在28避光保存，有效期15個(gè)月?；旌虾?8可穩(wěn)定1個(gè)月，室溫可穩(wěn)定3天 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：100mg/Dl(5.55mmol/L) 實(shí)驗(yàn)樣品：新鮮無溶血血清第七頁，共三十六頁。實(shí)驗(yàn)操作1. 酶工作液配置（直接用試劑盒）2. 標(biāo)本處理抽取全血 3-5 mL37保溫15分鐘3000轉(zhuǎn)/min離心10min取上清液備用第八頁，共三十六頁。3. 取3支干凈干燥的小試管按表加入試劑4. 各管加好后混勻，置37水浴

3、 30min，0.5cm光徑比色杯，以空白試劑調(diào)零，在500nm波長下比色先加體積少的，再加多的 管號(hào)試劑空白管標(biāo)準(zhǔn)管待測管蒸餾水(L ）10標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖(L ）10待測血清(L ）10酶工作液(mL ）1.51.51.5第九頁，共三十六頁。 標(biāo)準(zhǔn)液吸取后應(yīng)立即上蓋，以防水分揮發(fā) 工作液混濁或有絮狀物視為失效 本法特異性高，維生素C，谷胱甘肽，左 旋多巴引起負(fù)偏差 10l液體必須全部溶于1.5ml酶工作液中注意 10L液體不易精確加入，實(shí)驗(yàn)時(shí)要仔細(xì)檢查移液槍的密封性。此外，移液槍外壁不要沾有液體。第十頁，共三十六頁。二、酶法（COD-PAP）測血清總膽固醇(TC)第十一頁，共三十六頁。實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼?/p>

4、握酶法測定血清總膽固醇含量的原理熟悉酶法測定血清總膽固醇含量的操作方法了解總膽固醇測定的臨床意義第十二頁，共三十六頁。膽固醇酯酶+FFA膽甾烯酮+ H2O2膽固醇氧化酶COD實(shí)驗(yàn)原理+4-氨基安替比林+酚醌亞胺過氧化物酶H2O2PAP膽固醇酯 游離膽固醇第十三頁，共三十六頁。紅色的醌型化合物在510nm處有吸收峰，顏色深淺與總膽固醇的濃度成正比。采用標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比法可計(jì)算其含量?？偰懝檀己空⒖贾捣秶鸀榈谑捻?，共三十六頁。實(shí)驗(yàn)器材 小試管（3）、試管架 刻度吸量管2mL（1）、洗耳球 微量加樣器(20l) 恒溫水浴箱 離心機(jī)、離心管10ml（2）第十五頁，共三十六頁。實(shí)驗(yàn)試劑 R1液：磷酸鹽緩

5、沖液、對(duì)氯酚 R2液：4-氨基安替比林、酶 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液：5.2mmol/L第十六頁，共三十六頁。實(shí)驗(yàn)步驟 1. 工作試劑配制： R1 10ml+R2 1ml混合，可保存1周 2. 標(biāo)本處理:抽取全血35ml37保溫15分鐘3000轉(zhuǎn)/min離心10min取上清液備用最適樣品為當(dāng)日空腹采集無溶血無乳糜的血清。第十七頁，共三十六頁。3. 取3支小試管編號(hào)，按表加入試劑 管號(hào) 試劑空白管標(biāo)準(zhǔn)管待測管蒸餾水（l）10標(biāo)準(zhǔn)液（l）10樣品（l）10工作試劑（ml）0.60.60.6充分混合，37水浴15分鐘蒸餾水（ml）1.01.01.00.5cm光徑比色杯，以空白試劑調(diào)零，在510nm波長下比色第十

6、八頁，共三十六頁。注意事項(xiàng) 最后加酶工作試劑，各管反應(yīng)時(shí)間應(yīng)一致 工作試劑防止葡萄糖和甘油三酯污染 若需檢測游離膽固醇含量，將酶試劑去掉膽固醇酯酶即可第十九頁，共三十六頁。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 計(jì)算結(jié)果 記錄結(jié)果A標(biāo)=標(biāo)準(zhǔn)管吸光度A待=待測管吸光度 C待=A待A標(biāo)C標(biāo)C標(biāo)=血液中葡萄糖或膽固醇濃度C標(biāo)=標(biāo)準(zhǔn)液中葡萄糖或膽固醇濃度第二十頁，共三十六頁。血清葡萄糖測定臨床意義病理性高血糖： 常見于糖尿??；顱內(nèi)壓升高，如顱內(nèi)出血，顱外傷等；脫水引起的高血糖，如嘔吐、腹瀉和高熱等也可使血糖升高；胰島 細(xì)胞瘤等 病理性低血糖： 常見于胰島素分泌異常、肝功能嚴(yán)重衰退等；嚴(yán)重肝病患者，肝臟不能有效地調(diào)節(jié)血糖；糖原

7、累積癥。第二十一頁，共三十六頁。危險(xiǎn)閾值：高膽固醇血癥：6.2mmol/LTC增高：常見于動(dòng)脈粥樣硬化、高脂蛋白血癥、梗阻性黃疸、腎病綜合征、甲狀腺功能低下、慢性腎功能衰竭、糖尿病等 TC降低：常見于低脂蛋白血癥、貧血、肝臟疾病、營養(yǎng)吸收不良、惡性腫瘤等。血清總膽固醇測定臨床意義第二十二頁，共三十六頁。思考題 正常人的血糖為什么能維持在一定水平? 胰島素和腎上腺素對(duì)血糖有何影響? 為什么? 測定血清總膽固醇的臨床意義有哪些？返回目錄第二十三頁，共三十六頁。 722型分光光度計(jì) 能在可見光譜區(qū)域內(nèi)對(duì)樣品物質(zhì)作定量分析。廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、臨床檢驗(yàn)、生物化學(xué)、石油化工、環(huán)境保護(hù)、質(zhì)量控制，是生物化

8、學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用分析儀器之一。第二十四頁，共三十六頁。原理 不同的物質(zhì)對(duì)光的吸收具有選擇性，有其各自的吸收光譜。當(dāng)某單色光通過溶液時(shí)，能量會(huì)被吸收而減弱，能量減弱程度和物質(zhì)濃度有一定關(guān)系第二十五頁，共三十六頁?！癕ODE”鍵： 用于設(shè)置測試方式“100%T”鍵： 用于自動(dòng)調(diào)整100.0%T(100.0透射比)或零吸光度 “0%T”鍵： 用于自動(dòng)調(diào)整零透射比“波長設(shè)置”旋鈕： 用于設(shè)置分析波長722E型第二十六頁，共三十六頁。比色皿的使用方法 拿比色皿時(shí)，只能拿毛玻璃面，不能碰透光面，以免污染 使用前，一般先用水沖洗，再用蒸餾水潤洗，還要用所盛溶液潤洗 外壁的水用擦鏡紙或吸水紙沾干，以保護(hù)透光面 所

9、盛液體量約占總體積的3/4，即距管口1cm左右 第二十七頁，共三十六頁。722E型分光光度計(jì)操作方法1. 預(yù)熱儀器（關(guān)蓋，拉半檔，T模式） 2. 選定波長 5. 調(diào) T=100 (關(guān)蓋，拉桿全推進(jìn)，光路對(duì)著空白管）4. 調(diào) T= 0% (關(guān)蓋，拉半檔，光路對(duì)著1、2格間的擋板） 3. 放入樣品（光面對(duì)著光路的方向）7. 將模式調(diào)至“A”，拉動(dòng)拉桿至標(biāo)準(zhǔn)管和樣本管，分別測定A值并記錄8. 按回“T”模式，推回半檔的位置，拿出比色皿，關(guān)機(jī) 6. 重復(fù)4-5步至儀器顯示數(shù)值穩(wěn)定。第二十八頁，共三十六頁。返回光路第二十九頁，共三十六頁。返回光路第三十頁，共三十六頁。返回第三十一頁，共三十六頁。注意事項(xiàng)

10、 每更換一次波長，重新調(diào)“0”和“100%”； 每次做完實(shí)驗(yàn)后，應(yīng)立即洗凈比色皿 為了防止光電管疲勞，不測定時(shí)必須將光路切斷， 以延長光電管使用壽命 當(dāng)儀器停止工作時(shí)，切斷電源，并用套子蓋住儀 器，做好使用登記 第三十二頁，共三十六頁。 朗伯比爾定律： A= c l：摩爾吸光系數(shù) c：溶液的濃度 l：液層的厚度 A：物質(zhì)的吸光度 當(dāng)某單色光通過溶液時(shí)，其能量就會(huì)被吸收而減弱，光能量減弱的程度和物質(zhì)的濃度有一定的比例關(guān)系，也即符合于比色原理-朗伯-比耳定律 第三十三頁，共三十六頁。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論2. 計(jì)算結(jié)果1. 記錄結(jié)果A標(biāo)=標(biāo)準(zhǔn)管吸光度A待=待測管吸光度 C待=A待A標(biāo)C標(biāo)C標(biāo)=血液中葡萄糖濃度C標(biāo)=標(biāo)準(zhǔn)液中葡萄糖濃度第三十四頁，共三