細胞凋亡及其相關進展.428課件

細胞凋亡(diāowánɡ)及其相關進展昆明(kūnmínɡ)醫(yī)學院神經(jīng)科學研究所殷露瑋第一頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--281.細胞凋亡的概述2.細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導途徑3.重要(zhòngyào)的凋亡調(diào)控基因

4.常見細胞凋亡檢測方法內(nèi)容第二頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28細胞凋亡(diāowánɡ)的概述一、細胞凋亡的概念(gàiniàn)1．凋亡概念的形成

1972年，Kerr發(fā)現(xiàn)，結(jié)扎鼠門靜脈后，電鏡觀察到肝實質(zhì)組織中有一些細胞體積收縮、染色質(zhì)凝集。這些細胞從其周圍的組織中脫落并被吞噬且機體無炎癥反應。1972年Kerr等首次提出了細胞凋亡(Apoptosis)

的概念。Apoptosis一詞來源于希臘，原意指秋天樹葉的凋落以及花瓣的散落，其語源是apo(off,離去之意),ptosis(falling，凋落之意）。第三頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28英國人悉尼(xīní)·布雷內(nèi)、美國人羅伯特·霍維茨和英國人約翰·蘇爾斯頓，。（2002年）“fortheirdiscoveriesconceringgeneticregulationoforganofdevelopmentandprogrammedcelldeath”第四頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28

英國科學家悉尼·布雷內(nèi)。1951年在南非威特沃特斯蘭大學完成了他的碩士學業(yè)，1954年取得英國牛津大學博士學位，現(xiàn)任職于美國加利福尼亞州伯克利的分子科學研究所。他選擇線蟲作為新穎的實驗生物模型，這種獨特的方法使得基因分析能夠和細胞的分裂、分化，以及器官的發(fā)育聯(lián)系起來，并且能夠通過顯微鏡追蹤這一系列過程(guòchéng)。布雷內(nèi)在英國劍橋完成的這些發(fā)現(xiàn)為他獲得諾貝爾獎奠定了基礎。第五頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28秀麗隱桿線蟲1090－131＝959（cells）屬無脊椎動物線形動物門線蟲綱個頭小1mm最大特點：體細胞數(shù)恒定發(fā)現(xiàn)線蟲ced3

49基因直接(zhíjiē)與細胞凋亡相關，而且這些基因在高等哺乳類動物也有普遍意義。

第六頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--282．細胞凋亡(diāowánɡ)的概念細胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因嚴格控制的細胞自主的有序死亡。也常常被稱為細胞程序死亡（programmedcelldeath）凋亡細胞被吞噬細胞吞噬。第七頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28第八頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--284．細胞凋亡與細胞程序性死亡的區(qū)別細胞凋亡一詞出現(xiàn)之前的1965年，Lockshin等在研究蛾的變態(tài)發(fā)育過程中已發(fā)現(xiàn)存在著細胞程序性死亡（Programmedcelldeath，PCD）現(xiàn)象。

——PCD是個功能性的概念(gàiniàn)，描述在一個多細胞生物體中某些細胞死亡是個體發(fā)育中,一個預定的并受到嚴格程序控制的正常組成部分。

—— 細胞凋亡則是一個形態(tài)學的概念，描述一件有著一整套形態(tài)學特征的與壞死完全不同的細胞死亡形式。第九頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--283．細胞凋亡的生理意義組織(zǔzhī)分化、器官發(fā)育免疫系統(tǒng)的動態(tài)平衡（損傷修復和衰老細胞的清除）抵御外界各種因素干擾舉例：1.胸腺

2.哺乳期乳腺發(fā)育第十頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28

凋亡(diāowánɡ)時細胞的形態(tài)學改變

空泡化固縮出芽(chūyá)邊集凋亡(diāowánɡ)小體第十一頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28第十二頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)﹐是一種能夠與DNA中大部分A，T堿基相互(xiānghù)結(jié)合的熒光染料﹐常用與熒光顯微鏡觀測。因為DAPI可以透過完整的細胞膜﹐它可以用于活細胞和固定細胞的染色。

第十三頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28熒光染料標記(Hoechst33342、PI)的凋亡細胞(染色質(zhì)凝聚).流式細胞儀鑒別(jiànbié):正常細胞:低藍(hocehest+)/低紅(PI+);凋亡細胞:高藍(hocehest++)/低紅(PI+）壞死細胞:低藍(hocehest+)/高紅(PI++);

第十四頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28二、細胞(xìbāo)凋亡的形態(tài)學及生化特征1．細胞凋亡的形態(tài)學特征往往涉及單個細胞。凋亡細胞連接消失，與周圍的細胞脫落。細胞體積變小(皺縮)，細胞質(zhì)濃縮。胞膜結(jié)構(gòu)完整，有泡狀突起。細胞核染色質(zhì)濃縮，聚集核膜周圍。在胞漿中出現(xiàn)由降解的胞漿和胞核成分(chéngfèn)包裹于膜性成分(chéngfèn)中形成的凋亡小體(Apoptoticbodies)。無內(nèi)容物外溢，因而不引起周圍的炎癥反應。第十五頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28生化(shēnɡhuà)特征細胞色素(sèsù)C誘導細胞凋亡不同時間DNA電泳圖第十六頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28生化(shēnɡhuà)特征1胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高(繼而激活核酸內(nèi)切酶發(fā)生最早)。2細胞內(nèi)活性氧增多。3RNA/蛋白質(zhì)合成(說明凋亡是主動耗能過程與某些基因表達變化有關)。4DNA內(nèi)切酶活性被激活升高，雙鏈DNA在核小體之間切斷形成185bp為基數(shù)的有序片段(piànduàn)。5Ⅱ型谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶和需鈣蛋白酶（Calpain）活性升高。注：Ⅱ型谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶是Ca2+依賴酶，可促進蛋白質(zhì)谷氨酰胺與賴氨酸殘基之間的交聯(lián)，使細胞膜出現(xiàn)凹陷、皺縮，促進凋亡小體的形成。另外絲氨酸蛋白酶（如粒酶B),一氧化氮合酶（NOS),PARP,calpain,等也參與細胞的凋亡過程。第十七頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28細胞(xìbāo)凋亡的生化改變和凋亡有關的兩個酶DNase作用：切割染色質(zhì)DNA特點：Ca2+/Mg2+增強活性，Zn2+抑制(yìzhì)其活Casepases作用：滅活凋亡抑制物水解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，形成凋亡小體水解凋亡相關活性蛋白特點：一類特異的在天冬氨酸之后切割靶蛋白的半胱氨酸蛋白酶家族（cysteine-containingaspartate-specificprotease）第十八頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28細胞(xìbāo)壞死的概述一般過程：因補體反應(fǎnyìng)或烈性病毒感染破壞了質(zhì)膜，或者能量依賴性離子泵被破壞產(chǎn)生的鈉鉀等離子沿著各自的濃度梯度進入細胞，從而導致細胞吸水膨脹，最終破膜而死。特征：線粒體膨脹，細胞骨架降解，溶酶體釋放，細胞核內(nèi)染色質(zhì)沉淀靠近核膜邊，蛋白質(zhì)合成下降，由于膜破裂，出現(xiàn)炎癥反應。第十九頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--283．細胞凋亡與細胞壞死的區(qū)別細胞壞死細胞凋亡細胞形態(tài) 腫脹(zhǒngzhàng) 皺縮胞漿腫脹濃縮 胞膜 受損完整、泡狀核染色質(zhì) 染色質(zhì)不規(guī)則,移位濃縮聚集核膜周DNA斷裂方式不規(guī)則在核小體間整倍性斷裂結(jié)局 崩潰 凋亡小體誘導原因 病理生理或病理基因調(diào)控 -

+炎癥反應 有 無第二十頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28壞死(huàisǐ)細胞凋亡細胞第二十一頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28第二十二頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28第二十三頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28細胞(xìbāo)凋亡的過程大致分為如下四個階段：凋亡信號轉(zhuǎn)導凋亡基因激活凋亡的執(zhí)行(zhíxíng)凋亡細胞的清除第二十四頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28第二十五頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28第二十六頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28誘導細胞凋亡(diāowánɡ)的因子

物理性因子：射線(紫外線X射線等)，較溫和的溫度刺激(如熱激冷激)等化學及生物因子：活性氧基團(jītuán)和分子,DNA和蛋白質(zhì)合成的抑制劑,激素,細胞生長因子缺失,腫瘤壞死因子（TNF)第二十七頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28細胞凋亡(diāowánɡ)的分子調(diào)控機理線蟲（C.clengans）凋亡研究(yánjiū)發(fā)現(xiàn)ced3、ced4基因促進細胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制細胞凋亡。Ced3哺乳類同源物是ICE（interleukin－1－converingenzyme）即Caspase-1Ced4哺乳類同源物97年被證實為Apaf-1(apoptosisproteaseactivtingfactor)一種細胞凋亡蛋白酶活化因子）Ced-9哺乳類對應物較早證實為Bcl-2

總結(jié):ced3殺手基因

ced4即使殺手基因又是存活基因且為兩者的聯(lián)系因子

ced9存活基因

第二十八頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28

細胞凋亡(diāowánɡ)的信號轉(zhuǎn)導途徑

細胞凋亡的過程：接受凋亡信號 凋亡調(diào)控子間的相互作用Caspase激活和級聯(lián)反應(fǎnyìng) 死亡底物的活化 細胞凋亡細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導的兩大途徑： 由死亡受體(Fas、TNFR)介導的外源途徑。在這條途徑中，caspase-8首先被激活；線粒體介導的內(nèi)源途徑。在這條途徑中，caspase-9首先被激活。細胞凋亡后期的共同途徑：Caspase的激活。第二十九頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28

凋亡(diāowánɡ)過程如何發(fā)生？第三十頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28Caspase致細胞(xìbāo)凋亡變化機制1．凋亡抑制物

正常(zhèngcháng)活細胞核酸酶和抑制物結(jié)合CAD-ICAD，Caspase激活的脫氧核糖核酸酶（caspase-activated

deoxyribonulease

CAD）2．破壞細胞結(jié)構(gòu)

核纖層蛋白(核膜的骨架結(jié)構(gòu))作為底物被Caspase裂解染色質(zhì)的固縮

3．調(diào)節(jié)蛋白喪失功能

作用于幾種與細胞骨架調(diào)節(jié)有關的酶或蛋白，改變細胞結(jié)構(gòu)DNA修復有關的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交聯(lián)蛋白第三十一頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28

胞外信號分子誘導(yòudǎo)的細胞凋亡途徑

一、死亡受體介導的凋亡途經(jīng)（外源途徑）

死亡受體均屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族，它們(tāmen)與相應的配體（Ligand）結(jié)合后信號分子相互聚集并于細胞內(nèi)銜接蛋白（adapotorprotein）結(jié)合，這些銜接蛋白又募集在受體部Procaspase相互活化產(chǎn)生級聯(lián)反應，使細胞凋亡。

第三十二頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28

下游Caspase活化后，作用于底物，核纖層蛋白，導致細胞核形成凋亡小體；裂解Dnase結(jié)合蛋白，使Dnase釋放，降解DNA形成DNAladder；裂解參與細胞連接或附著的骨架(gǔjià)和其他蛋白,使凋亡細胞皺縮、脫落，便于細胞吞噬；導致膜質(zhì)PS重排,便于吞噬細胞識別并吞噬。TNFR超家族成員及其配體分子主要包括Fas(又稱CD95)

/FasL、TNFR/TNF、DR3及TRAILR/TRAIL。第三十三頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28死亡(sǐwáng)受體介導的凋亡途經(jīng)示意圖第三十四頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28

二、線粒體介導的凋亡(diāowánɡ)途經(jīng)線粒體不僅是細胞能量代謝的中心，而且在起源于細胞內(nèi)部的死亡信號所誘導的細胞凋亡中處于中心位置。這些細胞內(nèi)部的死亡信號源自各種因素，如DNA損傷(sǔnshāng)、氧化壓力、X-射線、化療藥物、營養(yǎng)缺乏等等。因而，線粒體所介導的凋亡途徑又稱為細胞凋亡的內(nèi)源途徑，其過程大致如下:1．線粒體滲透轉(zhuǎn)運孔（PTP）的開放和線粒體跨膜電位（△ψ）的消失，Bcl-2家族蛋白對于PT孔的開放和關閉起關鍵的調(diào)節(jié)作用2.細胞色素c從線粒體中的釋放和Caspase-9的激活.第三十五頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28凋亡(diāowánɡ)信號轉(zhuǎn)導途徑第三十六頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28

2004年4月21日，美國科學院宣布，王曉東被選為該院院士，這是美國科學界的最高榮譽。在目前的美國科學院院士中，42歲的王曉東是最年輕的一位。主要研究領域(lǐnɡyù)：細胞凋亡的生化途徑。第三十七頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28凋亡(diāowánɡ)的調(diào)控細胞凋亡是多基因嚴格控制的過程。這些基因在種屬之間非常(fēicháng)保守，如Caspase家族、Bcl-2家族、抑癌基因P53、IAP家族等。抑制凋亡基因：Bcl-2，IAP（凋亡抑制蛋白）促進凋亡基因：wtP53，Bax，ICE（caspases亞型）雙向調(diào)控基因：c-myc，Bcl-x第三十八頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28一、Caspase是凋亡的執(zhí)行者Caspase(Cysteineaspartaticacicspecificprotease)：在特異的天冬氨酸之后切割靶蛋白的一類進化上保守的半胱氨酸蛋白酶。又稱半胱天冬酶（胱冬蛋白酶）。1．Caspase家族特征Caspase通常以酶原（Procaspase）的形式存在，相對分子質(zhì)量為29-49kD。N末端具有一個原結(jié)構(gòu)域（Prodomain），C端同源(tónɡyuán)區(qū)存在半胱氨酸激活位點，此激活位點結(jié)構(gòu)域為QACX(G、Q或R)G。第三十九頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--282.Caspases的分類根據(jù)在細胞凋亡中起的作用，Caspases分為兩大類：啟始Caspase(Initiator)和效應(xiàoyìng)Caspase(Effector)1）啟始Caspases包括-2，-8，-9，-10等，對細胞凋亡的刺激信號作出反應，啟動細胞的凋亡過程；2）效應Caspases包括-3，-6，-7等，是在細胞凋亡過程中的具體執(zhí)行者，完成對特定蛋白底物的水解。第四十頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28Caspase活化基本有兩種機制，即同源(tónɡyuán)活化和異源活化，這兩種活化方式密切相關，一般來說后者是前者的結(jié)果，發(fā)生同源活化的Caspase又被稱為啟動caspase.通常caspase-8,

10,

2介導死亡受體通路的細胞凋亡，分別被募集到Fas和TNFR1死亡受體復合物，而Caspase-9參與線粒體通路的細胞凋亡，則被募集到Cyt

c/d

ATP/Apaf-1組成的凋亡體（apoptosome）。

異源活化（hetero-activation）即由一種caspase活化另一種caspase是凋亡蛋白酶的酶原被活化的經(jīng)典途徑。被異源活化的Caspase又稱為執(zhí)行caspase.執(zhí)行Caspase不象啟動Caspase

，不能被募集到或結(jié)合起始活化復合體，它們必須依賴啟動Caspase才能活化。

第四十一頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28圖：ICE家族(jiāzú)成員A：3類caspase：藍色參與炎癥反應，紅色為執(zhí)行者，綠色為啟動者；B：caspase-3的結(jié)構(gòu)模型；C：caspase-3的活化過程引自KatjaC.Zimmermann等2001

第四十二頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--283．Caspase激活的機制非活化(huóhuà)的Procaspase（前體）存在，其激活依賴于以其他的caspase在他的天冬位點裂解（釋放一個大亞基和一個小亞基，形成四聚體）活化或自身活化。當Caspase-8活化后，他一方面作用于Procaspase－3，另一方面使Bid裂解成兩個片段，其中含BH3結(jié)構(gòu)域的C-端被運送到線粒體，域Bcl-2/Bax的BH3結(jié)構(gòu)域形成復合物，導致細胞色素C釋放。Cytc與胞質(zhì)中ced－4同原物Apaf－1結(jié)合并活化Apaf－1，再活化procaspase-9，最后引起凋亡。第四十三頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28Caspase以一種有序的的方式(fāngshì)對細胞進行“破壞”，通過切斷細胞與周圍的聯(lián)系，拆散細胞骨架，阻斷細胞DNA復制和修復，干擾mRNA剪切，損傷DNA與核結(jié)構(gòu)，從而使細胞降解為凋亡小體。因此，可以說Caspase在細胞凋亡過程中的作用處于中心地位。第四十四頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28Bcl-2家族、線粒體與細胞(xìbāo)凋亡Bcl-2是一種原癌基因，是ced-9在哺乳動物中的同原物，能誘導細胞凋亡；與線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相結(jié)合；Bcl-2蛋白(dànbái)羧基末端有一穿膜的結(jié)構(gòu)域，Bcl-2家族成員的基因中，常常含有三個保守的Bcl-2同源區(qū)，及BH1，BH2,BH3.第四十五頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28

二、Bcl-2基因(jīyīn)家族

根據(jù)它們對細胞凋亡(diāowánɡ)作用結(jié)果的不同，可將Bcl-2家族成員分為兩類：

一類能抗細胞凋亡，如Bcl-2、Bcl-xL、Al、Bcl-w、Mcl-1。在這類分子中，都含有Bcl-2同源區(qū)1-4(Bcl-2homologydomains，BH1-BH4)的結(jié)構(gòu)。另一類能促進細胞凋亡，有Bax、Bak、Bcl-xS、Bik、Bad、Bid、Hrk。在這類分子中，根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)特點，又分為兩個亞族：①Bax亞族，如Bax、Bak、Bok，都有BH1、BH2和BH3的結(jié)構(gòu)；②BH3-only亞族（只有BH3的結(jié)構(gòu)），如Bik、Bad、Bid、Hrk，。第四十六頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28圖Bcl-2家族(jiāzú)引自KatjaC.Zimmermann等2001第四十七頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28Bcl-2基因(jīyīn)家族的結(jié)構(gòu)特征抑制細胞凋亡(diāowánɡ)所必需促進細胞(xìbāo)凋亡所必需第四十八頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28

summary

Bcl-2家族各成員可以形成(xíngchéng)二聚體，二聚體中的某一單體對另一單體的功能具有促進或抑制作用。因此某一細胞中抑制因子與激活因子的比例決定了細胞是否發(fā)生凋亡。第四十九頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28IAP(inhibitorofapoptosisprotein)

為一組具有抑制凋亡作用的蛋白質(zhì)，首先是從桿狀病毒基因組克隆到。在人類中，已發(fā)現(xiàn)IAP至少有五種：c-IAP1、c-IAP2、NIAP、XIAP和Survivin。

1．IAP的特征：

IAP家族是哺乳動物體內(nèi)唯一被發(fā)現(xiàn)的Caspase抑制劑。所有的IAP都含有(hányǒu)對抗凋亡作用非常重要。三、

IAP家族(jiāzú)第五十頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28．IAP的拮抗蛋白果蠅中對IAP有拮抗作用的蛋白：Reaper,HidandGrim。在哺乳類中,2000年Wang和Vaux領導的兩個實驗室同時分別發(fā)現(xiàn)了Smac和DIABLO。結(jié)果證明為同一蛋白。故稱此蛋白為Smac/DIABLO。Smac/DIABLO在凋亡中的兩個功能：i）結(jié)合在IAP上，拮抗IAP的作用，促進凋亡。ii）促使(cùshǐ)procaspase3從無活性形式切割成成熟形式。研究發(fā)現(xiàn)Smac/DIABLO的N端的7個氨基酸，對其激活caspase3的能力是必須的。此7個氨基酸序列與Reaper,Hid與Grim中的14個氨基酸的序列是保守的。第五十一頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28

四、P53基因(jīyīn)家族

1．P53基因（分子警察）

p53并非為所有細胞的凋亡過程所必需，但對DNA損傷而誘發(fā)的細胞凋亡卻是必不可少的。1）p53的兩大功能：

使細胞在G1期停滯。當DNA由于各種原因損傷后，p53首先誘導細胞進入G1期，抑制細胞增殖，直至損傷的DNA修復。一旦DNA不能被修復，p53就會活化那些(nàxiē)誘導細胞凋亡的基因轉(zhuǎn)錄，使細胞發(fā)生凋亡。野生型P53還可逆轉(zhuǎn)變異細胞為正常細胞。第五十二頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28例如caspase-8切割胞質(zhì)促凋亡蛋白Bid。Bid是Bcl-2家族中只包含BH3domain的亞家族中的一員。Bid經(jīng)切割后轉(zhuǎn)移至線粒體膜，和Bad結(jié)合，誘導細胞色素c（cytochromec）從線粒體中釋放出來。Cytochromec再依次使Apaf-1激活casepase-9。在多數(shù)情況(qíngkuàng)下這種交叉是少見的，兩條通路一般獨立發(fā)揮作用。

線粒體和死亡受體凋亡(diāowánɡ)通路緊密結(jié)合第五十三頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28

細胞(xìbāo)凋亡檢測

一、AnnexinV-FITC(結(jié)合膜表PS實驗）二、細胞培養(yǎng)液LDH活性檢測三、核DNA片段檢測

1.DNALadder2.Tunel

法（優(yōu)點：原位標記，定量分析）四、形態(tài)學鑒定鏡檢（DNA特異性染料Hochest33342，33258，DAPI)五、細胞凋亡反應核心(héxīn)因子檢測六、流式細胞分析（Heochst33342/PI雙染色法）注：AnnexinV-FITC是一種標記有熒光素的鈣依賴磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有很高的親和力，可特異性的與磷脂酰絲氨酸結(jié)合。第五十四頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28第五十五頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28第五十六頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28第五十七頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28

流式細胞術分析細胞周期時相實驗(shíyàn)原理

流式細胞儀（FlowCytometryFCM）的工作原理是將待測細胞放入樣品管中，在氣體的壓力下進入充滿鞘液的流動室。在鞘液的約束下細胞排成單列由流動室的噴嘴噴出，形成細胞柱。通過對流動液體中排列成單列的細胞進行逐個檢測，得到該細胞的光散射和熒光指標，分析出其體積、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等物理及化學特征。細胞內(nèi)的DNA含量隨細胞周期進程發(fā)生周期性變化，如G0/G1期的DNA含量為2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI標記的方法(fāngfǎ)，通過流式細胞儀對細胞內(nèi)DNA的相對含量進行測定，可分析細胞周期各時相的百分比。第五十八頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28神經(jīng)細胞凋亡（體外培養(yǎng)）的研究模型(móxíng)與應用1神經(jīng)營養(yǎng)因子的撤除與神經(jīng)細胞凋亡的誘導神經(jīng)生長因子（NGF)，腦源性神經(jīng)生長因子（BDNF）在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中重要作用，維持神經(jīng)元存活(cúnhuó)和功能?？捎脽o生長因子、無血清培養(yǎng)基、或加入生長因子抗體制作誘導凋亡模型。2低鉀引起的細胞凋亡（培養(yǎng)小腦粒細胞KCl濃度小于5mmol/l）3一氧化氮與細胞凋亡神經(jīng)元、內(nèi)生型皮細胞、膠質(zhì)細胞和巨噬細胞損傷后均可產(chǎn)生iNOS（誘生型一氧化氮合酶）。缺血性損傷可激活NO合酶。加入NO供體（如硝普納）可誘導細胞凋亡。第五十九頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28第六十頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--284

氧化損傷與神經(jīng)細胞凋亡原理同前，過量活性氧（reactiveoxygensppeciesROS）包括氧自由基和過氧化氫(ɡuòyǎnɡhuàqīnɡ)，引起氧化應急損傷。腦組織對氧化損傷尤為敏感。神經(jīng)細胞凋亡被證實是缺血再灌注死亡經(jīng)神主要形式。氧化損傷參與急慢性神經(jīng)退行性疾病發(fā)生發(fā)展過程。AD中A-beta（淀粉樣蛋白）沉積誘導氧自由基形成和氧化損傷。暴露于過量過氧化氫或凋亡。提供NO供體誘導5蛋白磷酸酶和蛋白激酶抑制劑與細胞凋亡蛋白磷酸酶抑制劑抑制蛋白磷酸化，破壞蛋白功能，細胞死亡。神經(jīng)細胞中，藻毒素（OA)可使tau蛋白磷酸化，突觸結(jié)構(gòu)改變。第六十一頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--286DNA損傷制劑與核苷（阿糖胞苷）7鈣離子(lízǐ)的神經(jīng)毒作用線粒體內(nèi)鈣超負荷，引起線粒體膜通透性改變，細胞色素C釋放，激活Caspase。8興奮型神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)毒作用谷氨酸濃度過高，神經(jīng)毒作用，機制可能與鈣離子濃度升高、自由基形成。半胱氨酸蛋白酶（caspase）激活等有關。9beta－淀粉樣蛋白與神經(jīng)細胞凋亡10脂類與細胞凋亡11紫外線照射與細胞凋亡第六十二頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28神經(jīng)細胞(shénjīnɡxìbāo)凋亡形態(tài)學檢測1臺盼蘭排斥實驗測定細胞膜完整性臺盼藍(TrypanBlue)是檢測細胞(xìbāo)膜完整性最常用的生物染色試劑。健康的正常細胞(xìbāo)能夠排斥臺盼藍，而死亡的細胞(xìbāo)，膜的完整性喪失，通透性增加，細胞(xìbāo)可被臺盼藍染成藍色。依據(jù)此原理，細胞(xìbāo)經(jīng)臺盼藍染色后，可通過顯微鏡，直接鏡下計數(shù)或拍照后計數(shù)，實現(xiàn)對細胞(xìbāo)存活率比較精確的定量分析。第六十三頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28

2細胞Hoechst染色Hoechst33342是一種(yīzhǒnɡ)可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，對細胞的毒性較低。

正常細胞膜，Hoechst33342能少許進入染上低藍色。凋亡細胞的膜通透性增強，進入凋亡細胞中的Hoechst33342較正常細胞多，熒光強度較高。此外，細胞凋亡后DNA的結(jié)構(gòu)改變使染料更有效地結(jié)合DNA，并且凋亡細胞膜上的p-糖蛋白泵損傷不能染料排出都使凋亡細胞的藍色熒光增強。而PI染料是不能進入細胞膜完整的正常細胞和凋亡細胞中，即活細胞對PI染料拒染，而壞死細胞由于膜完整性在早期即已破損，可被PI染料染色。

第六十四頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28根據(jù)這些特性，用Hoechst33342結(jié)合PI染料對凋亡細胞進行雙染色(rǎnsè)，就可在流式細胞儀上將正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞區(qū)別開來。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，這三群細胞表現(xiàn)分別為：正常細胞為低藍色/低紅色（Hoechst33342+/PI+），凋亡細胞為高藍色/低紅色（Hoechst33342++/PI+），壞死細胞為低藍色/高紅色（Hoechst33342+/PI++）。第六十五頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28

熒光染料(rǎnliào)標記（Hocest、PI）的凋亡細胞（染色質(zhì)凝聚）

第六十六頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--283細胞質(zhì)和細胞核的分化染色細胞核用酸性染料染色，細胞質(zhì)這用堿性染料著色?？赏瑫r觀察細胞質(zhì)和細胞核的形態(tài)學變化。4細胞膜磷脂酰絲氨酸暴露由于AnnexinV-FITC(fluuoresceinisothiocyanate)也可標記壞死細胞(xìbāo)，不特異。結(jié)合PI區(qū)分壞死及凋亡細胞。AnnexinV-FITC陽性且PI著色提示為壞死細胞。AnnexinV-FITC隱性且PI未染色提示為正常細胞。AnnexinV-FITC陽性且PI無染色提示為凋亡早期細胞。（AnnexinV-FITC陽性呈細胞表面綠色熒光，PI染色呈胞漿紅色).5掃描電子顯微鏡觀察方法6透射電鏡觀察方法第六十七頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28原位末端標記（TUNEL法）實驗(shíyàn)原理細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是分階段、漸進的過程，染色體DNA首先在內(nèi)源性核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段，然后在Ca2+和Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，大約30﹪的染色體DNA在核小體單位之間被隨機切斷，形成(xíngchéng)180-200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口即可產(chǎn)生一系列DNA的3’-OH末端。在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物可標記到DNA的3’-OH末端，通過酶顯色反應來進行凋亡細胞的識別和檢測稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法（TUNELTdT-mediateddUTPnickendlabeling）第六十八頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28原位細胞凋亡(diāowánɡ)檢測（TUNEL法）原理第六十九頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28原位細胞(xìbāo)凋亡檢測（TUNEL法）實驗程序第七十頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28第七十一頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28實驗(shíyàn)試劑1．TUNEL-POD試劑盒（Roch公司，批號(pīhào):11684817910）試劑1:末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（TdT酶）試劑2:含有核苷酸混合液的反應液試劑3:酶標記抗熒光素抗體2．DAB試劑盒（北京中山金橋公司）試劑Ａ：Tris-HCl緩沖液試劑B：DAB溶液試劑C：過氧化氫溶液3．脫氧核糖核酸酶I（15000USigma公司）第七十二頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28主要(zhǔyào)試劑的配制1．0.2MA液和0.2MB液A液：稱取NaH2PO4·2H2O（分子量136.08）27.6g，雙蒸水溶解后倒入1000ml容量瓶中，加雙蒸水至終刻度。B液：稱取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.628g，雙蒸水溶解后倒入1000ml容量瓶中,加雙蒸水至終刻度。2．0.2mol/LPB液取A液19ml，B液81ml，充分混合，室溫(shìwēn)保存。第七十三頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--283．0.01mol/LPBS緩沖液取NaCl8.5-9g及0.2mol/LPB50ml加入1000ml容量瓶中，加雙蒸水至1000ml充分搖勻，室溫(shìwēn)保存。4．0.1mol/LHCl溶液取0.84ml濃鹽酸（HCl比重1.19，含量37%）加蒸餾水至100ml，充分混合，室溫保存。5．100mmol/LTris-HCl取Tris3.025g（Tris三羥甲基氨基甲烷，分子量為121.14）溶于200ml雙蒸水中充分攪拌溶解，用濃鹽酸約3ml調(diào)節(jié)pH值至6.4，最后加雙蒸水定容至250ml，棕色瓶裝，室溫保存。第七十四頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--287．0.1%DEPC水1mlDEPC（二乙基焦碳酸酯）原液加入1000ml單蒸水中，間歇劇烈振蕩，避光室溫(shìwēn)靜置12h以上。8．20μg/ml蛋白酶K1mg/ml儲備液：取蛋白酶K1mg加入10mMTris-HCl（pH7.4-8.0）1ml充分混合后，分裝成40份，－20℃儲存，用時再凍融；20ug/ml工作液（臨用前配制）：取蛋白酶K儲備液5μl加入10mMTris-HCl245μl再次稀釋，混合均勻。9．3%H2O2-甲醇取3%H2O240μl，加入2.0ml甲醇中（按1：50），混合均勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

第七十五頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--28實驗(shíyàn)步驟1．染色前處理

（1)玻片預先用多聚賴氨酸或APES進行處理。（包被(bāobèi)目的以防止染色中切片脫落）

（2)組織固定：常規(guī)4%多聚甲醛/0.01MPBS(pH7.0-7.6)或10%中性甲醛固定4h以上，石蠟包埋。（目的最大限度保持組織細胞原有形態(tài)結(jié)構(gòu)）（3)石蠟切片常規(guī)脫蠟入水二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各5-10min(脫蠟務必干凈)，然后放入100%、95%、90%、80%、70%等各級酒精溶液中各3-5min，再放入蒸餾水中3min。第七十六頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--2810．TUNEL反應液1液1μl；2液9μl，混勻，置于冰上備用(bèiyòng)。11．二氨基聯(lián)苯（DAB）溶液1ml單蒸水中加入A液，B液，C液各一滴（約50μl）混合均勻，避光保存，30min內(nèi)使用完。12．5%牛血清白蛋白（BSA）0.5mg牛血白蛋白加入10ml單蒸水中溶解。注意應先加牛血清白蛋白，再加入單蒸水混勻時避免漩渦混勻，4℃保存。第七十七頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--2813．脫氧核糖核酸酶I（DnaseI）將15000U

DnaseI溶解于0.15M氯化鈉溶液（5mg/ml）1ml中，分裝成50份，－80℃保存。每份20μl，每次取20μl加入0.15M氯化鈉溶液中180μl再次(zàicì)稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。第七十八頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--282．每張切片加一滴或50μl新鮮稀釋至20μg/ml的蛋白酶K（10mMTris-HCl147μl加入1mg/ml蛋白酶K3μl），37℃消化30min，0.01MPBS洗5min×3次(細胞涂片和冰凍切片一般不消化或消化10-60s，新鮮石蠟切片消化5-10min，陳舊石蠟切片消化10-30min)。陽性對固定過程中照加入DnaseI室溫(shìwēn)孵育10min0.01MPBS洗5min×3次。（目的暴露固定過程中因交聯(lián)作用被遮蔽的蛋白抗原，同時部分消化細胞膜利于后續(xù)試劑的進入）第七十九頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--283．0.1%DEPC水浸泡，室溫30min。0.01MPBS洗5min×3次。（目的減少消除外源性核酸內(nèi)切酶造成的假陽性）4．標記甩去切片上多余液體，標本片擦干組織及周邊水分(shuǐfèn)，按每張切片滴加凋亡試劑盒1液和2液（按照1：9比例，在一次性PE手套上配制，多次抽吸，混合均勻）配成TUNEL反應混合液（冰上操作）；陰性對照組只加入試劑2液，而不加1液；標本上覆蓋塑料蓋片，置樣品于濕盒中，37℃標記1h，4℃過夜（20h以上）。0.01MPBS洗5min×3次。(目的熒光素標記的寡核苷酸在TdT酶作用下與凋亡細胞內(nèi)斷裂的DNA片段結(jié)合）第八十頁，共九十一頁。細胞凋亡及其相關進展.--4--285．新鮮配制3%H2O2-甲醇，室溫孵育15min。0.01MPBS液洗滌5min×3次。（目的封閉內(nèi)源性的過氧化物酶）6．每張切片加5%牛血清白蛋白封閉液50μl，37℃30min，甩掉封閉液，不洗。（目的封閉醛固定后醛基和生物負電荷)