慶大霉素的生產(chǎn)工藝課件

氨基糖苷類(lèi)

慶大霉素慶大霉素一.氨基糖苷類(lèi)的總述二.慶大霉素1.概述-結(jié)構(gòu)與性質(zhì)2.藥代動(dòng)力學(xué)3.制備原理4.工藝路線5.工藝過(guò)程6.代謝調(diào)控7.最新成果氨基糖苷類(lèi)的總述氨基糖苷類(lèi)抗生素（Aminoglycosides）是由氨基糖與氨基環(huán)醇通過(guò)氧橋連接而成的苷類(lèi)抗生素。有來(lái)自鏈霉菌的鏈霉素等、來(lái)自小單孢菌的慶大霉素等天然氨基糖苷類(lèi)，還有阿米卡星等半合成氨基糖苷類(lèi)。雖然大多數(shù)抑制微生物蛋白質(zhì)合成的抗生素為抑菌藥，但氨基糖苷類(lèi)抗生素卻可起到殺菌作用，屬靜止期殺菌藥。

氨基糖苷類(lèi)抗生素可起到殺菌作用，屬靜止期殺菌藥。其殺菌作用具有如下特點(diǎn)：1.殺菌作用呈濃度依賴(lài)性。2.僅對(duì)需氧菌有效，尤其對(duì)需氧革蘭陰性桿菌的抗菌作用強(qiáng)。3.具有明顯的抗生素后效應(yīng)。

4.具有首次接觸效應(yīng)。

5.在堿性環(huán)境中抗菌活性增強(qiáng)。

慶大霉素是由絳紅小單孢菌、棘孢小單孢菌等發(fā)酵產(chǎn)生的氨基糖苷類(lèi)抗生素,是由22脫氧鏈霉胺、絳紅糖胺、加拉糖胺組成的多組分混合物,并以C族復(fù)合物為主。22脫氧鏈霉胺分別在4、6位上通過(guò)苷鍵連接絳紅糖胺和加拉糖胺,因絳紅糖胺C6c上的甲基化程度不同,形成了C1、C2、C1a3個(gè)主要組分,其結(jié)構(gòu)如圖所示。這3個(gè)組分中,C1、C2、C1a的療效和毒性互不相同:C1組分毒副作用最小且不易產(chǎn)生耐藥性,但療效稍差;C2和C1a組分療效高,但毒性較大且容易產(chǎn)生耐藥性。

性狀：常用其硫酸鹽，為白色或類(lèi)白色結(jié)晶性粉末；無(wú)臭；有引濕性。在水中易溶，在乙醇、乙醚、丙酮或氯仿中不溶。藥代動(dòng)力學(xué)一.功能主治對(duì)大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、克雷白桿菌、奇異變形桿菌、某些吲哚變形桿菌、綠膿桿菌、某些奈瑟菌、某些無(wú)色素沙雷桿菌和志賀菌等革蘭陰性菌有抗菌作用。革蘭陽(yáng)性菌中，金黃色葡萄球菌對(duì)該品敏感；鏈球菌對(duì)該品耐藥。厭氧菌、結(jié)核桿菌、立克次體、病毒和真菌亦對(duì)該品耐藥。近年來(lái)，由于該品的廣泛應(yīng)用，耐藥菌株逐漸增多，綠膿桿菌、克雷白桿菌和沙雷桿菌、吲哚陽(yáng)性變形桿菌對(duì)該品的耐藥率甚高。對(duì)金葡菌及大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌，奇異變形桿菌，綠膿桿菌等G－菌作用較強(qiáng)。適用于敏感細(xì)菌所致的新生兒膿毒癥、敗血癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染（包括腦膜炎）、尿路生殖系統(tǒng)感染、呼吸道感染、胃腸道感染（包括腹膜炎）、膽道感染、皮膚、骨骼、中耳炎、鼻竇炎、軟組織感染（包括燒傷）、李斯特菌病。二.藥物的相互作用1.與其他氨基糖苷類(lèi)合用或先后連續(xù)應(yīng)用，可增加耳毒性、腎毒性以及神經(jīng)肌肉阻滯作用的可能性。與神經(jīng)肌肉阻滯藥合用，可加重神經(jīng)肌肉阻滯作用。2.與卷曲霉素、順鉑、依他尼酸、呋塞米或萬(wàn)古霉素等合用或先后連續(xù)應(yīng)用，可增加耳毒性與腎毒性的可能性。3.與頭孢噻吩合用可能增加腎毒性。4.與多粘菌素類(lèi)合用或先后連續(xù)應(yīng)用，可增加腎毒性和神經(jīng)肌肉阻滯作用。5.其他腎毒性及耳毒性藥物均不宜與該品合用或先后連續(xù)應(yīng)用，以免加重腎毒性或耳毒性。四.適合癥狀①該品適用于綠膿桿菌、變形桿菌(吲哚陽(yáng)性和陰性)、大腸桿菌、克雷伯菌屬、腸桿菌屬、沙雷菌屬、枸櫞酸桿菌屬以及葡萄球菌(包括耐青霉素(G)與耐甲氧西林菌株)所致的新生兒膿毒癥、敗血癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染(包括腦膜炎)、尿路生殖系統(tǒng)感染、呼吸道感染、胃腸道感染(包括腹膜炎)、膽道感染、皮膚、骨骼、中耳炎、鼻竇炎；軟組織感染(包括燒傷)、李斯特菌??；②該品用于綠膿桿菌或葡萄球菌所嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染時(shí)(腦膜炎、腦室炎)，可同時(shí)用該品鞘內(nèi)注射作為輔助治療；③該品不適用于單純性尿路感染初治，除非病原菌對(duì)其他毒性較低的抗菌藥物不敏感，該品對(duì)鏈球菌中的多數(shù)菌種(尤其D組)、肺炎球菌和厭氧菌(如類(lèi)桿菌屬或梭狀芽胞桿菌屬)無(wú)效；④該品口服可用于腸道感染或結(jié)腸手術(shù)前準(zhǔn)備，也可用該品肌注合并克林霉素或甲硝唑以減少結(jié)腸手術(shù)后感染率。注意事項(xiàng)(1)應(yīng)監(jiān)測(cè)血藥濃度，尤其在新生兒、老年和腎功能不全的患者。慶大霉素的有效治療濃度范圍為4一10μg/ml。應(yīng)避免高峰血藥濃度持續(xù)在12μg/ml以上和谷濃度超過(guò)2μg/ml。但外科、婦科、產(chǎn)科或燒傷患者由于個(gè)體差異較大，按計(jì)算劑量可能低于最小常用量或超過(guò)最大常用量。接受慶大霉素鞘內(nèi)注射者應(yīng)同時(shí)監(jiān)測(cè)腦脊液內(nèi)藥物濃度。(2)不能測(cè)定血藥濃度時(shí)，應(yīng)根據(jù)測(cè)得的肌酐清除率調(diào)整劑量。(3)患者應(yīng)給予充足的水分，以減少腎小管損害。(4)長(zhǎng)期應(yīng)用可能導(dǎo)致耐藥菌過(guò)度生長(zhǎng)。不良反應(yīng)(1)曾有報(bào)道慶大霉素全身應(yīng)用合并鞘內(nèi)注射時(shí)引起腿部抽搐、皮疹、發(fā)熱和全身痙攣等。慶大霉素引起腎功能減退的發(fā)生率較妥布霉素為高。大劑量用藥容易導(dǎo)致水腫(2)發(fā)生率較多者有聽(tīng)力減退、耳鳴或耳部飽滿感(耳毒性)、血尿、排尿次數(shù)顯著減少或尿量減少、食欲減退、極度口渴(腎毒性)、步履不穩(wěn)、眩暈(耳毒性，影響前庭；腎毒性)。發(fā)生率較低者有呼吸困難、嗜睡、極度軟弱無(wú)力(神經(jīng)肌肉阻滯或腎毒性)。(3)停藥后如發(fā)生聽(tīng)力減退、耳鳴或耳部飽滿感，需引起注意。不良反應(yīng)與卡那霉素進(jìn)近似，用量小時(shí)反應(yīng)較輕.如用量大，療程長(zhǎng)，偶見(jiàn)腸道菌群紊亂，一旦出現(xiàn)即停藥，可恢復(fù)正常.可有白細(xì)胞減少，聽(tīng)力及腎損害.個(gè)別病例口周、面部和四肢皮膚發(fā)麻，眩暈,耳鳴.偶有過(guò)敏性休克，主要癥狀為呼吸道阻塞及循環(huán)障礙、半數(shù)以上病例經(jīng)搶救無(wú)效而死亡，故有人認(rèn)為該品的最嚴(yán)重的不良反應(yīng)為速發(fā)型過(guò)敏性休克.可引起羅姆伯格氏癥(閉目難立，暗處和洗臉時(shí)站不穩(wěn))中毒癥狀。耐藥機(jī)制1、產(chǎn)生鈍化酶：如磷酸化酶、腺苷化酶、乙?；?。2、細(xì)胞膜通透性下降。3、修飾靶蛋白（p10蛋白）。缺乏主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)功能：如厭氧菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)的耐藥性。制備原理慶大霉素的生產(chǎn)是采用五級(jí)發(fā)酵形式，離子交換樹(shù)脂的方法進(jìn)行產(chǎn)品的分離精制。慶大霉素產(chǎn)生菌絳紅小單孢菌或棘孢小單孢菌經(jīng)孢子制備、搖瓶菌絲培養(yǎng)后接入種子罐，種子經(jīng)過(guò)一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)擴(kuò)級(jí)培養(yǎng)后接入發(fā)酵罐。發(fā)酵過(guò)程中控制溫度、通氣量、pH、補(bǔ)料等各項(xiàng)工藝參數(shù)，4~6天發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附、洗脫、脫色、濃縮和干燥可得慶大霉素成品。硫酸慶大霉素工藝流程（二）孢子制備和種子培養(yǎng)1.孢子制備孢子萌發(fā)培養(yǎng)基(%):1號(hào)培養(yǎng)基:K2HP40.01,NaCl0.05,MgSO40.05,葡萄糖0.1,小麥汁2.0;2號(hào)培養(yǎng)基:K2HP40.01,NaCl0.05,MgSO40.05,小麥汁2.0;3號(hào)培養(yǎng)基:NaCl0.05,MgSO40.05,小麥汁2.0.孢子萌發(fā)的影響條件1、p H值：當(dāng)小單孢菌發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH7.0時(shí),菌絲生長(zhǎng)快,慶大霉素合成起步早,產(chǎn)抗期延長(zhǎng).同樣是5天的周期,而它的發(fā)酵水平最高.說(shuō)明慶大霉素代謝合成最適pH值比孢子萌發(fā)pH值略高.2、溫度的影響：溫度是孢子萌發(fā)的重要條件,它影響萌發(fā)的速度和百分率.菌株培養(yǎng)溫度由30→34℃時(shí),萌發(fā)率相差幾倍.當(dāng)溫度由34→36℃,大部份菌株發(fā)芽率達(dá)最大值,最適溫度為36℃.3、溶氧對(duì)孢子萌發(fā)的影響：溶氧對(duì)孢子萌發(fā)也是不可缺少的因素.振蕩培養(yǎng)12h的萌發(fā)率相當(dāng)于靜止培養(yǎng)17h的狀況.以相同的培養(yǎng)時(shí)間,前者比后者萌發(fā)率提高30%～45%.振蕩培養(yǎng)17h,萌發(fā)率高達(dá)41%～60%.4、孢子的密度與萌發(fā)的關(guān)系：當(dāng)?shù)攘颗囵B(yǎng)液中接入不同量的孢子時(shí),萌發(fā)率隨著密度的增加而相應(yīng)地降低.這可能與斜面孢子在貯藏過(guò)程中菌絲自溶釋放出某些物質(zhì)濃度過(guò)大而對(duì)孢子萌發(fā)具有抑制作用有關(guān).同時(shí)存在高密度孢子萌發(fā)所需營(yíng)養(yǎng)顯得不足.5、生長(zhǎng)因子對(duì)孢子萌發(fā)的影響：出對(duì)孢子萌發(fā)最有效的生化因子甘氨酸、纈氨酸、絲氨酸,經(jīng)雙因子組合試驗(yàn),孢子萌發(fā)率最高可達(dá)74.2%,由此證明絳紅色小單孢菌孢子萌發(fā)率低的主要因素可能與缺乏某些氨基酸及一些生長(zhǎng)因素這些簡(jiǎn)單營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有關(guān).種子培養(yǎng)基一級(jí)種培養(yǎng)基配方原配方比例%新配方比例%葡萄糖0.150.1淀粉1.21.0蛋白胨0.30.2黃豆餅粉1.01.0玉米粉1.51.5硝酸鉀0.050.05碳酸鈣0.50.4二級(jí)種配方原配方比例%新配方比例%葡萄糖1.01.0淀粉2.01.5蛋白胨0.40.3玉米粉1.81.5黃豆餅粉3.23.0花生餅粉0.40.25硫酸銨0.050.05硫酸鈣0.80.8泡敵0.0250.025工藝提取采用732陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，利用離子交換法從發(fā)酵液中提取慶大霉素。最優(yōu)的提取條件為:發(fā)酵液pH2～3，吸附時(shí)間2h，解吸劑濃度5%，解吸劑流速0．4mL/min。經(jīng)HPLC測(cè)定，發(fā)酵液通過(guò)離子交換法分離提取后，慶大霉素純度為92．5%。離子交換法適用于慶大霉素發(fā)酵液的分離提取，提取液純度達(dá)到藥物分析的要求。提取流程732型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂是一種強(qiáng)酸型的樹(shù)脂，pH對(duì)其活性基團(tuán)影響不大;慶大霉素是一種弱堿性的抗生素，pH對(duì)其影響較大。在中性環(huán)境中，它主要以三價(jià)陽(yáng)離子的形式存在，能與陽(yáng)離子樹(shù)脂進(jìn)行離子交換，而在堿性環(huán)境中，慶大霉素以陰離子的形式存在，與陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的交換能力非常弱，導(dǎo)致在堿性條件下吸附率急劇下降。而在酸性環(huán)境中主要以五價(jià)陽(yáng)離子的形式存在，更加穩(wěn)定，親和力較強(qiáng)，所以具有更高的離子交換能力，因而在酸性條件下吸附率比較大。轉(zhuǎn)速、解吸劑流速、解吸劑濃度對(duì)其陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的最終提取結(jié)果也有影響添加氨基酸后其在微生物細(xì)胞內(nèi)的作用機(jī)理往往可歸納為幾種類(lèi)型:（1）氨基酸脫去氨基后形成的碳骨架通過(guò)特定的代謝途徑進(jìn)入TCA循環(huán),增加了TCA循環(huán)的代謝通量,從而提高了細(xì)胞的能量水平,促進(jìn)了細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物合成,因此小單孢菌菌絲粗壯,細(xì)胞染色深,發(fā)酵液粘稠,縮短了生長(zhǎng)期,提前進(jìn)入產(chǎn)素期.（2）由于氨基酸是一種兩性離子,具有調(diào)節(jié)胞內(nèi)生理pH值的功能，并能促使pH最大限度地滿足細(xì)胞生理功能的需要.本研究證明新方法pH值明顯高于原工藝,pH偏堿性更有利于絳紅色小單孢菌細(xì)胞的代謝和產(chǎn)素.（3）抑制或激活相關(guān)代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性,從而促進(jìn)目的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的提高。

大量實(shí)驗(yàn)說(shuō)明主要是激活初級(jí)代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性,從而促使在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞代謝旺盛,周期縮短,產(chǎn)素率得到明顯提高.（4）氨基酸通過(guò)特定代謝途徑產(chǎn)生目的代謝途徑中所需的輔酶或中間代謝物包括前體物。

新方法所用的蛋氨酸(甲硫氨酸)無(wú)論對(duì)于原核細(xì)胞還是真核細(xì)胞的代謝都是重要的中間代謝物質(zhì).在生物體中蛋氨酸(甲硫氨酸)是通過(guò)5-腺苷甲硫氨酸合成酶消耗ATP,使甲硫氨酸腺苷化而合成腺苷甲硫氨酸(SAM).SAM是生物體內(nèi)最重要的甲基供體,在生命活動(dòng)過(guò)程中,使細(xì)胞內(nèi)許多重要物質(zhì)如核酸、蛋