豬丹毒桿菌的檢驗分析課件

實驗六

豬丹毒桿菌檢驗實驗六

豬丹毒桿菌檢驗1一、實驗?zāi)康?、學(xué)習(xí)掌握豬丹毒桿菌檢驗的基本原理和方法；2、了解檢驗豬丹毒桿菌的意義。一、實驗?zāi)康?、學(xué)習(xí)掌握豬丹毒桿菌檢驗的基本原理和方法；2二、實驗說明豬丹毒(Swineerysipelas)是由豬丹毒桿菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)引起的一種人畜共患傳染病，其主要特征為高熱、急性敗血癥、皮膚疹塊、慢性疣狀心內(nèi)膜炎及皮膚壞死與多發(fā)性非化膿性關(guān)節(jié)炎。豬丹毒桿菌分為兩個種，即紅斑丹毒絲菌和扁桃體丹毒絲菌，其中僅紅斑丹毒絲菌是具有致病力的毒力種，對豬最易感并有很強的致病性，至今已發(fā)現(xiàn)la,1b,2-24和N型共26個血清型，大約80%以上的豬源性分離株屬1型(la和1b)和2型，我國優(yōu)勢血清型也為1a,1b和2型。

二、實驗說明豬丹毒(Swineerysipela3“大紅袍”類丹毒不規(guī)則鮮紅色斑塊“大紅袍”類丹毒不規(guī)則鮮紅色斑塊4大紫腎：典型的敗血脾;腎淤血、腫大心瓣膜增生：疵狀心內(nèi)膜炎的病變，二尖瓣和主動脈瓣出現(xiàn)菜花樣增生物脾充血腫大大紫腎：典型的敗血脾;腎淤血、腫大心瓣膜增生：疵狀心內(nèi)5三、檢驗程序三、檢驗程序6四、操作步驟（一）增菌

以無菌操作取檢樣，用乳缽加滅菌砂磨碎，無菌操作將樣品轉(zhuǎn)至營養(yǎng)肉湯中，于36℃士1℃培養(yǎng)8h~10h。（二）分離和培養(yǎng)

對沒有受污染的新鮮病料可直接接種在血液瓊脂或血清瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24～48h?；蚪?jīng)TSB肉湯37℃培養(yǎng)24h后，再轉(zhuǎn)種于血液瓊脂或血清瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h。四、操作步驟（一）增菌7血清瓊脂：菌落特征：細小、圓形、透明、凸起、灰白色、有光澤、質(zhì)軟、露珠樣、易混懸于鹽水中。血清瓊脂：菌落特征：細小、圓形、透明、凸起、灰白色、8血液瓊脂：菌落形態(tài)同血清瓊脂，此外形成綠色的狹窄溶血環(huán)（α溶血）血液瓊脂：菌落形態(tài)同血清瓊脂，此外形成綠色的狹窄溶血環(huán)（α溶9TSB肉湯：輕度混濁，振動試管呈現(xiàn)出云霧狀，類似試管刷，有少量灰白色粘稠沉淀，不形成菌膜和菌環(huán)。TSB肉湯：輕度混濁，振動試管呈現(xiàn)出云霧狀，類似試管刷，有少10革蘭氏染色，顯微鏡觀察：分離菌均為革蘭氏陽性桿菌，菌體細長、長短不一，有時呈長絲形，單獨存在，有時呈短鏈或V形排列。革蘭氏染色，顯微鏡觀察：分離菌均為革蘭氏陽性桿菌，菌體細長、11四、操作步驟（三）生化實驗自TSA瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺。以無菌操作將各菌分別穿刺接種至SIM培養(yǎng)基中，將所有試管置于37℃下培養(yǎng)24-48小時。四、操作步驟（三）生化實驗12如試管5：本試驗可觀察乳糖和葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸不產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。如試管5：本試驗可觀察乳糖和葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸不產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)13四、操作步驟（三）生化實驗將被檢菌穿刺接種于明膠培養(yǎng)基，于20℃培養(yǎng)7天，逐日觀察明膠液化現(xiàn)象。如室溫高，培養(yǎng)基自行溶化時，可與冰箱內(nèi)放置30分鐘，然后取出觀察結(jié)果，不再凝固時為陽性。V-P試驗、靛基質(zhì)試驗、硝酸鹽還原試驗檢驗。四、操作步驟（三）生化實驗14四、操作步驟（三）生化實驗項目結(jié)果項目結(jié)果葡萄糖﹢枸鹽酸鹽-乳糖﹢靛基質(zhì)-果糖﹢硫化氫﹢蔗糖-甘露醇-山梨醇-七葉苷-鼠李糖-木糖-M.R.(甲基紅)-V-P-氧化酶-過氧化氫酶-硝酸鹽還原-明膠不液化注：＋表示陽性;－表示陰性。四、操作步驟（三）生化實驗項目結(jié)果項目結(jié)果葡萄糖﹢枸鹽酸鹽-15（四）聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）

豬丹毒桿菌的檢測步驟1、引物：P1：5'-CGATTATATTCTTAGCACGCACGCAACG-3'P2：5‘-TGCTTGTGTTGTGATTTCTTGACG-3'（四）聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainRe16豬丹毒桿菌的檢測步驟2、反應(yīng)體系反應(yīng)總體積為25μL，其中含有12.5μL的PCRMasterMix，10μmol/L上、下游引物各1μL,1μg/LDNA模板5μL，滅菌雙蒸水6.5μL。（四）聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）

豬丹毒桿菌的檢測步驟（四）聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymeras17豬丹毒桿菌的檢測步驟3、反應(yīng)條件：95℃，5min95℃，1min63℃，1min40次循環(huán)72℃，1min72℃，10min（四）聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）

豬丹毒桿菌的檢測步驟（四）聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymeras18（四）聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）

豬丹毒桿菌的檢測步驟4、DNA的提?。簩⒈粰z菌株接種于3mLTSB肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)(150r/min)10~12h后，取1mL培養(yǎng)液于1.5mL離心管中，經(jīng)12000r/min4℃離心5min，棄去上清液，用200μLddH2O或者TE緩沖液(pH8.0)重懸沉淀，再于沸水浴中10min，隨后立即在冰中冷卻，然后在12000r/min及4℃條件下離心5min，取上清液為豬丹毒桿菌基因組DNA模板。（四）聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainRe19豬丹毒桿菌的檢測步驟5、電泳檢測：取5μLPCR產(chǎn)物直接經(jīng)1%瓊脂凝膠（含0.5μg/mL溴化乙錠）電泳，凝膠成像儀上觀察拍照結(jié)果。（四）聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）

豬丹毒桿菌的檢測步驟（四）聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymeras20937bpM123420001000750500250100豬丹毒桿菌PCR檢測結(jié)果電泳圖說明：M—DL2000；1—陽性對照；2、3——被檢樣品；4—陰性對照。（四）聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）

937bpM12342021四、操作步驟四、動物實驗1.實驗材料實驗動物：雌性昆明小鼠，體重18~22g器材：1ml注射器，鼠籠，墊料（所有器皿均經(jīng)高壓消毒）。四、操作步驟四、動物實驗22四、操作步驟四、動物實驗2.實驗步驟每組取2只小鼠，以每只0.2mL劑量進行一次性腹腔注射1只，另一只注射0.2mL無菌生理鹽水，觀察，分別記錄小鼠死亡狀況。四、操作步驟四、動物實驗23四、操作步驟四、動物實驗3.病理解剖和細菌分離病理解剖，觀察小鼠的內(nèi)臟病理變化；無菌取小鼠的脾臟，觸于血清平板，37℃培養(yǎng)12~18h。記錄結(jié)果。四、操作步驟四、動物實驗24（六）結(jié)果與報告綜合以上生化試驗、PCR鑒定和動物實驗的結(jié)果，報告樣品中檢出或未檢出豬丹毒桿菌。（六）結(jié)果與報告25實驗六

豬丹毒桿菌檢驗實驗六

豬丹毒桿菌檢驗26一、實驗?zāi)康?、學(xué)習(xí)掌握豬丹毒桿菌檢驗的基本原理和方法；2、了解檢驗豬丹毒桿菌的意義。一、實驗?zāi)康?、學(xué)習(xí)掌握豬丹毒桿菌檢驗的基本原理和方法；27二、實驗說明豬丹毒(Swineerysipelas)是由豬丹毒桿菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)引起的一種人畜共患傳染病，其主要特征為高熱、急性敗血癥、皮膚疹塊、慢性疣狀心內(nèi)膜炎及皮膚壞死與多發(fā)性非化膿性關(guān)節(jié)炎。豬丹毒桿菌分為兩個種，即紅斑丹毒絲菌和扁桃體丹毒絲菌，其中僅紅斑丹毒絲菌是具有致病力的毒力種，對豬最易感并有很強的致病性，至今已發(fā)現(xiàn)la,1b,2-24和N型共26個血清型，大約80%以上的豬源性分離株屬1型(la和1b)和2型，我國優(yōu)勢血清型也為1a,1b和2型。

二、實驗說明豬丹毒(Swineerysipela28“大紅袍”類丹毒不規(guī)則鮮紅色斑塊“大紅袍”類丹毒不規(guī)則鮮紅色斑塊29大紫腎：典型的敗血脾;腎淤血、腫大心瓣膜增生：疵狀心內(nèi)膜炎的病變，二尖瓣和主動脈瓣出現(xiàn)菜花樣增生物脾充血腫大大紫腎：典型的敗血脾;腎淤血、腫大心瓣膜增生：疵狀心內(nèi)30三、檢驗程序三、檢驗程序31四、操作步驟（一）增菌

以無菌操作取檢樣，用乳缽加滅菌砂磨碎，無菌操作將樣品轉(zhuǎn)至營養(yǎng)肉湯中，于36℃士1℃培養(yǎng)8h~10h。（二）分離和培養(yǎng)

對沒有受污染的新鮮病料可直接接種在血液瓊脂或血清瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24～48h?；蚪?jīng)TSB肉湯37℃培養(yǎng)24h后，再轉(zhuǎn)種于血液瓊脂或血清瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h。四、操作步驟（一）增菌32血清瓊脂：菌落特征：細小、圓形、透明、凸起、灰白色、有光澤、質(zhì)軟、露珠樣、易混懸于鹽水中。血清瓊脂：菌落特征：細小、圓形、透明、凸起、灰白色、33血液瓊脂：菌落形態(tài)同血清瓊脂，此外形成綠色的狹窄溶血環(huán)（α溶血）血液瓊脂：菌落形態(tài)同血清瓊脂，此外形成綠色的狹窄溶血環(huán)（α溶34TSB肉湯：輕度混濁，振動試管呈現(xiàn)出云霧狀，類似試管刷，有少量灰白色粘稠沉淀，不形成菌膜和菌環(huán)。TSB肉湯：輕度混濁，振動試管呈現(xiàn)出云霧狀，類似試管刷，有少35革蘭氏染色，顯微鏡觀察：分離菌均為革蘭氏陽性桿菌，菌體細長、長短不一，有時呈長絲形，單獨存在，有時呈短鏈或V形排列。革蘭氏染色，顯微鏡觀察：分離菌均為革蘭氏陽性桿菌，菌體細長、36四、操作步驟（三）生化實驗自TSA瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺。以無菌操作將各菌分別穿刺接種至SIM培養(yǎng)基中，將所有試管置于37℃下培養(yǎng)24-48小時。四、操作步驟（三）生化實驗37如試管5：本試驗可觀察乳糖和葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸不產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。如試管5：本試驗可觀察乳糖和葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸不產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)38四、操作步驟（三）生化實驗將被檢菌穿刺接種于明膠培養(yǎng)基，于20℃培養(yǎng)7天，逐日觀察明膠液化現(xiàn)象。如室溫高，培養(yǎng)基自行溶化時，可與冰箱內(nèi)放置30分鐘，然后取出觀察結(jié)果，不再凝固時為陽性。V-P試驗、靛基質(zhì)試驗、硝酸鹽還原試驗檢驗。四、操作步驟（三）生化實驗39四、操作步驟（三）生化實驗項目結(jié)果項目結(jié)果葡萄糖﹢枸鹽酸鹽-乳糖﹢靛基質(zhì)-果糖﹢硫化氫﹢蔗糖-甘露醇-山梨醇-七葉苷-鼠李糖-木糖-M.R.(甲基紅)-V-P-氧化酶-過氧化氫酶-硝酸鹽還原-明膠不液化注：＋表示陽性;－表示陰性。四、操作步驟（三）生化實驗項目結(jié)果項目結(jié)果葡萄糖﹢枸鹽酸鹽-40（四）聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）

豬丹毒桿菌的檢測步驟1、引物：P1：5'-CGATTATATTCTTAGCACGCACGCAACG-3'P2：5‘-TGCTTGTGTTGTGATTTCTTGACG-3'（四）聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainRe41豬丹毒桿菌的檢測步驟2、反應(yīng)體系反應(yīng)總體積為25μL，其中含有12.5μL的PCRMasterMix，10μmol/L上、下游引物各1μL,1μg/LDNA模板5μL，滅菌雙蒸水6.5μL。（四）聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）

豬丹毒桿菌的檢測步驟（四）聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymeras42豬丹毒桿菌的檢測步驟3、反應(yīng)條件：95℃，5min95℃，1min63℃，1min40次循環(huán)72℃，1min72℃，10min（四）聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）

豬丹毒桿菌的檢測步驟（四）聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymeras43（四）聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）

豬丹毒桿菌的檢測步驟4、DNA的提?。簩⒈粰z菌株接種于3mLTSB肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)(150r/min)10~12h后，取1mL培養(yǎng)液于1.5mL離心管中，經(jīng)12000r/min4℃離心5min，棄去上清液，用200μLddH2O或者TE緩沖液(pH8.0)重懸沉淀，再于沸水浴中10min，隨后立即在冰中冷卻，然后在12000r/min及4℃條件下離心5min，取上清液為豬丹毒桿菌基因組DNA模板。（四）聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainRe44豬丹毒桿菌的檢測步驟5、電泳檢測：取5μLPCR產(chǎn)物直接經(jīng)1%瓊脂凝膠（含0.5μg