山東大學(xué)生物化學(xué)核酸-02

第五章

核

酸生物化學(xué)

第四節(jié)核酸的性質(zhì)（一）酸水解對酸的敏感性：糖苷鍵＞磷酸酯鍵嘌呤糖苷鍵＞嘧啶糖苷鍵利用酸水解可以研究核酸的堿基組成。（二）堿水解RNA的磷酸酯鍵對堿敏感。DNA抗堿水解。生理意義：DNA更穩(wěn)定，遺傳信息。RNA是DNA的信使，完成任務(wù)后迅速降解。一、核酸的水解（三）酶水解非特異的磷酸二酯酶：蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5’-核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3’-核苷酸特異的磷酸二酯酶：核酸酶第四節(jié)核酸的性質(zhì)一、核酸的水解1、核酸酶的分類底物專一性：核糖核酸酶RNase脫氧核糖核酸酶DNase作用方式：核酸外切酶（exonuclease)、核酸內(nèi)切酶(endonuclease)。單鏈核酸酶、雙鏈核酸酶、雜鏈核酸酶磷酸二酯鍵的斷裂方式：5’-（寡）核苷酸3’-（寡）核苷酸核酸酶RNaseH作用于DNA-RNA中的RNA鏈牛胰核糖核酸酶（pancreaticribonuclease),RNaseI最適pH：7.0-8.2產(chǎn)物：以3’-嘧啶核苷酸結(jié)尾的寡核苷酸，高度專一的內(nèi)切酶RNaseT1耐熱、耐酸產(chǎn)物：以3’-鳥苷酸結(jié)尾的寡核苷酸，專一性更高RNaseT2產(chǎn)物：以3’-腺苷酸結(jié)尾的寡核苷酸核酸酶2、RNase核酸酶S1作用于單鏈DNA部分牛胰核糖核酸酶，DNaseI切斷雙鏈或單鏈DNA產(chǎn)物：以5’-磷酸為末端的寡核苷酸DNA限制性內(nèi)切酶具有非常嚴(yán)格的堿基序列專一性核酸酶3、DNase4、N-糖苷酶以限制性內(nèi)切酶及連接酶進(jìn)行核酸剪接GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCGAATTCGGCTTAAGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCGEcoRIDNALigaseEcoRIstickyendEcoRIstickyendJuangRH(2004)BCbasics目標(biāo)基因殖入質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化宿主菌1plasmid1cell重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主目標(biāo)基因殖入質(zhì)粒限制酶限制酶染色體目標(biāo)基因重組基因細(xì)胞轉(zhuǎn)化宿主菌JuangRH(2004)BCbasics二、

核酸的酸堿性質(zhì)P504核酸的磷酸基具有酸性，堿基具有堿性，因此，核酸具有兩性電離的性質(zhì)。但核酸中磷酸基的酸性大于堿基的堿性，其等電點(diǎn)偏酸性。DNA的pI約為4～5，RNA的pI約為2.0～2.5，在pH7～8電泳時(shí)泳向正極。第四節(jié)核酸的性質(zhì)1、堿基的解離p5052、核苷的解離P5053、核苷酸的解離P5064、核酸的滴定曲線P507三、

核酸的紫外吸收堿基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有強(qiáng)烈的光吸收，λmax=260nm第四節(jié)核酸的性質(zhì)1、鑒定純度純DNA的A260/A280應(yīng)為1.8（1.65-1.85）純RNA的A260/A280應(yīng)為2.0。若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低。2、含量計(jì)算1ABS值相當(dāng)于：50ug/mL雙螺旋DNA或：40ug/mL單鏈DNA（或RNA）或：20ug/mL寡核苷酸3、判斷DNA是否變性在DNA的變性過程中，摩爾吸光系數(shù)增大（增色效應(yīng)）在DNA的復(fù)性過程中，摩爾吸光系數(shù)減?。p色效應(yīng)）第四節(jié)核酸的性質(zhì)四、

核酸的變性、復(fù)性及雜交第四節(jié)核酸的性質(zhì)(一)變性P508核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，不涉及共價(jià)鍵斷裂。當(dāng)核酸的氫鍵在外界因素的影響下,發(fā)生斷裂,使兩條鏈分開,但不降解.叫核酸的變性.

第四節(jié)核酸的性質(zhì)1、影響核酸變性的因素:1).外因:凡能破壞氫鍵和堿基堆積力的因素,都是核酸變性的因素.如:A熱變性,B酸堿變性（pH小于4或大于11）,C有機(jī)試劑變性（尿素、鹽酸胍、甲醛）等.2).內(nèi)因:A.堿基的含量.(AT易變性,GC不易)B.DNA的均一性.C.堿基的順序效應(yīng).1).DNA的變性現(xiàn)象將DNA的稀鹽溶液加熱到80--1000C,幾分鐘后,DNA將發(fā)生一系列的物理化學(xué)性質(zhì)的改變(宏觀表現(xiàn)).260nm的紫外吸收值升高.(增色效應(yīng))比旋下降.粘度下降.浮力密度升高.酸堿滴定曲線改變.生物活性喪失.第四節(jié)核酸的性質(zhì)2、DNA的熱變性與Tm值增色效應(yīng)與減色效應(yīng)增色效應(yīng)：DNA變性過程中，摩爾吸光系數(shù)增大。減色效應(yīng)：DNA復(fù)性過程中，摩爾吸光系數(shù)減小。第四節(jié)核酸的性質(zhì)核酸的變性與復(fù)性Garrett&Grisham(1999)Biochemistry(2e)p.373增色效應(yīng)減色效應(yīng)DNA的變性是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個很窄的溫度范圍內(nèi)。HyperchromicEffect核酸變性觀察5070901.31.21.11.0Temperature(C)Relativeabsorbance(260nm)TmAdaptedfromVoetetal(1999)FundamentalofBiochemistryp.739DNA變性作用發(fā)生在一個很窄的溫度范圍內(nèi)。2、熔解溫度（Tm）：DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)對應(yīng)的溫度。濃度50ug/mL時(shí)，雙鏈DNAA260=1.00，完全變性（單鏈）A260=1.37當(dāng)A260增加到最大增大值一半時(shí)，即1.185時(shí)，對應(yīng)的溫度即為Tm。DNA的Tm一般在82—95℃之間溶解溫度Tm3、影響DNA的Tm值的因素①DNA均一性。均一性高，變性溫度范圍越窄，據(jù)此可分析DNA均一性。溶解溫度Tm核酸G+C組成分越高者Tm越大7080901001.41.21.0Relativeabsorbance(260nm)Temperature(°C)Pneumococcus肺炎球菌(38%)G+CE.coli(52%)S.Marcescens粘質(zhì)沙雷氏菌

(58%)M.Phlei分枝桿菌

(66%)AdaptedfromGarrett&Grisham(1999)Biochemistry(2e)p.372②G-C含量與Tm值成正比。測定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）×2.44P509核酸G+C含量與Tm值成正比③介質(zhì)中離子強(qiáng)度P509離子強(qiáng)度高，Tm高。Tm值與介質(zhì)中離子強(qiáng)度的關(guān)系陽離子中和核酸的負(fù)電荷而使Tm增大60708090100110100806040200Tm(C)G+C(%)0.15MNaCl0.015MNacitrate0.01Mphosphate0.001MEDTAAdaptedfromGarrett&Grisham(1999)Biochemistry(2e)p.3723’5’5’3’DNA分子的復(fù)性(二)、復(fù)性指經(jīng)加熱變性的DNA在適當(dāng)條件下，二條互補(bǔ)鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象，它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過程。熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過程稱之為退火(annealing)。DNA分子的復(fù)性復(fù)性機(jī)制：10-20bp成拉鏈熱變性DNA在緩慢冷卻時(shí)可以復(fù)性，快速冷卻不能復(fù)性。復(fù)性速度可用Co·t衡量。Co為變性DNA原始濃度mol·L-1，t為時(shí)間，以秒表示。變性DNA在適當(dāng)條件下（一般低于Tm值20~25℃），兩條鏈重新締合成雙螺旋結(jié)構(gòu)。核酸復(fù)性的速度與其基因組復(fù)雜度有關(guān)p51010-610-510-410-310-210-11101001K10K00.51.0Fractionreassociatedc0t(mole/L?

sec)1101021031041051061071081091010E.coliT4MS2Mousesatellite牛CalfPolyU/PolyAAdaptedfromGarrett&Grisham(1999)Biochemistry(2e)p.374復(fù)性所需時(shí)間(長)基因組大小分子雜交（三）分子雜交：(hybridization)

不同來源的核酸變性后，合并在一處進(jìn)行復(fù)性，這時(shí)，只要這些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成堿基互補(bǔ)配對的片段，復(fù)性也會發(fā)生于不同來源的核酸鏈之間，即形成所謂的雜化雙鏈，這個過程稱為雜交(hybridization)。1、SouthernBlottingDNA樣品→酶切→電泳→堿變性→轉(zhuǎn)膜→固定→雜交→洗滌→放射自顯影SouthernBlotting可用于DNA之間同源性分析，確定特異性DNA序列的大小和定位。(三)分子雜交分子雜交核酸分子間的雜交反應(yīng)

hybridizationRNADNA1DNA2探針SouthernhybridizationNorthernhybridizationJuangRH(2004)BCbasics雜交可以發(fā)生于DNA與DNA之間，也可以發(fā)生于RNA與RNA之間和DNA與RNA之間。Northernblotting（印跡法）SouthernBlotting的轉(zhuǎn)印Albertsetal(2002)MolecularBiologyoftheCell(4e)p.499取出轉(zhuǎn)印紙以探針雜交呈色Albertsetal(2002)MolecularBiologyoftheCell(4e)p.4992、

NorthernBlotting研究對象是mRNA，探針一般是DNA?？俁NA或mRNA需在變性條件下電泳（乙二醛、甲醛）3、

WesternBlotting抗原與抗體的雜交研究克隆基因表達(dá)產(chǎn)物、鑒定克隆株的常用技術(shù)。Northernblotting（印跡法）菌落轉(zhuǎn)印到濾紙后以探針雜合蓋上濾紙顯像呈色加入探針轉(zhuǎn)印中取出濾紙溶解細(xì)胞核酸變性JuangRH(2004)BCbasicsColonyhybridization樣本

DNA每一點(diǎn)上涂布有已知

DNA生物芯片Schena(2000)MicroarrayBiochipTechnology,p.A31互補(bǔ)的

DNA會互相雜合產(chǎn)生信號基因芯片利用雜交反應(yīng)JuangRH(2004)BCbasics第五節(jié)

核酸研究技術(shù)一、

核酸的分離純化和定量盡可能保持其天然狀態(tài)，防止降解和變性。條件溫和，防止過酸、過堿、劇烈攪拌。抑制核酸酶。（一）DNA分離純化真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高鹽溶液（1mol/LNaCl），但不溶于低鹽溶液（0.14mol/LNaCl），據(jù)此，采用高鹽提取，低鹽沉淀，可將DNP與RNA核蛋白分開，提取出DNP。DNP可用水飽和的酚抽提，去除蛋白質(zhì)。還可用氯仿異戊醇去除蛋白質(zhì)。水相中的DNA可被0.3MNaAC-70%乙醇沉淀。一、核酸的分離純化和定量（二）RNA的制備RNase的滅活：玻璃器皿：140-200°C，8小時(shí)；塑料器皿：0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)，37°C

，過夜提取液加鹽酸胍或異硫氰酸胍反應(yīng)體系中加RNasin等特異的RNase抑制劑一、核酸的分離純化和定量不同構(gòu)象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度離心可以將不同構(gòu)象DNA、RNA與蛋白質(zhì)區(qū)分開來。這一方法常用于質(zhì)粒DNA的純化。二、核酸的沉降特性與超速離心超螺旋DNA或（一）瓊脂糖電泳用于大片段DNA的分離，精度低，但分離范圍廣影響遷移率的因素：①

核酸分子的大小，遷移率與分子量的對數(shù)成反比②凝膠濃度③

DNA的構(gòu)象，超螺旋最快，環(huán)型其次，線型最慢。④

電壓，不大于5V/cm染色：0.5ug/mlEBRNA的瓊脂糖凝膠電泳一般要加入甲醛或戊二醛三、核酸的凝膠電泳瓊脂糖電泳可以用于DNA分子量的測定三、核酸的凝膠電泳（二）PAGE電泳

以聚丙烯酰胺作支持物，這種凝膠的孔徑比瓊脂糖膠要小，所以可用于分析相對分子質(zhì)量小于1000bp的DNA片段和RNA的電泳。聚丙烯酰胺凝膠強(qiáng)度較好，常用垂直板電泳。三、核酸的凝膠電泳(一)、

限制修飾系統(tǒng)

限制性內(nèi)切酶往往與一種甲基化酶同時(shí)成對存在，構(gòu)成一個限制修飾系統(tǒng)，甲基化酶使細(xì)菌自身的DNA帶上標(biāo)志，限制性內(nèi)切酶專門用于降解入侵的外源DNA。限制酶的命名，如：E.coRI第一位：屬名E（大寫）第二、三位：種名的頭兩個字母小寫co第四位：菌株R第五位：從該細(xì)菌中分離出來的這一類酶的編號四、限制性核酸內(nèi)切酶與DNA物理圖譜構(gòu)建（1979年發(fā)現(xiàn)p504）同裂酶：來源不同的限制酶（名稱自然不同），識別位點(diǎn)相同，切割位點(diǎn)相同，產(chǎn)生同樣的粘性末端。BamHI：GG↓ATCCBstI：GG↓ATCCMboI：GAT↓CSau3A：GAT↓C同尾酶：來源各異，識別的靶序列不同，但都產(chǎn)生相同的粘性末端。BclI：TG↓ATCABglII：AG↓ATCA四、限制性核酸內(nèi)切酶與DNA物理圖譜構(gòu)建(二)、

DNA物理圖譜及構(gòu)建（限制酶切圖譜、DNA酶切位點(diǎn)圖譜）在研究某一種DNA時(shí)，弄清該DNA分子有哪些限制酶切位點(diǎn)是很重要的。建立物理圖譜是進(jìn)一步分析此DNA的基礎(chǔ)。四、限制性核酸內(nèi)切酶與DNA物理圖譜構(gòu)建（一）雙脫氧終止法英國Sanger1955確定牛胰島素結(jié)構(gòu)，1958獲諾貝爾化學(xué)獎。1975設(shè)計(jì)出DNA測序法，1980獲諾貝爾化學(xué)獎。合成一段與待測DNA序列互補(bǔ)的DNA片段群。五、

DNA序列分析核酸測序原理PolyacrylamideGelElectrophoresisATC32PAT32PA32PTAGCTACGATCG32PATCGA32PATCGAT32PATCGATC32PATCGATCG32PATCGATCGA32PATCGATCGAT32P凝膠電泳泳可以分開各種不同長度的核酸，在電泳膠片依序排開︰但這樣的圖譜不能判別出各核酸端點(diǎn)的核苷酸種類若能把尾端核苷酸相同的片段提出，跑在同一行，由比較