《生物化學(xué)》實(shí)驗(yàn)講義

實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)及氨基酸的顏色反應(yīng)一、目的意義1、學(xué)習(xí)幾種鑒定氨基酸與蛋白質(zhì)的一般方法及其原理。2、學(xué)習(xí)和了解一些鑒定蛋白質(zhì)的特殊顏色反應(yīng)及其原理。二、實(shí)驗(yàn)原理1、雙縮脲反應(yīng)當(dāng)尿素加熱到180℃左右時(shí)，2分子尿素發(fā)生縮合放出1分子氨而形成雙縮脲.雙縮脲在堿性溶液中與銅離子結(jié)合生成復(fù)雜的紫紅色化合物,這一呈色反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有多個(gè)與雙縮脲相似的鍵，因此也具有雙縮脲的顏色反應(yīng).借此可以鑒定蛋白質(zhì)的存在或測定其含量。應(yīng)當(dāng)指出，雙縮脲反應(yīng)并非蛋白質(zhì)的特異顏色反應(yīng)，因?yàn)榉埠须逆I的物質(zhì)并不都是蛋白質(zhì).2、茚三酮反應(yīng)蛋白質(zhì)與茚三酮共熱,產(chǎn)生藍(lán)紫色化合物，此反應(yīng)為一切蛋白質(zhì)及α-氨基酸（除脯氨酸和羥脯氨酸）所共有。含有氨基酸的其他化合物也呈此反應(yīng).該反應(yīng)十分靈敏，1:1500000濃度的氨基酸水溶液就能呈現(xiàn)反應(yīng)。因此，此反應(yīng)廣泛用于氨基酸的定量測定.3、黃色反應(yīng)含有苯環(huán)側(cè)鏈的（特別是含酪氨酸）蛋白質(zhì)溶液與硝酸共熱時(shí)，呈黃色（硝基化合物)，再加堿則變?yōu)槌赛S色，此反應(yīng)也稱為黃蛋白反應(yīng)。三、儀器與試劑1、試劑(1)蛋白質(zhì)溶液：取10mL雞蛋清,用蒸餾水稀釋至100mL,攪拌均勻后用紗布過濾得上清液。（2)0。3％色氨酸溶液、0。3%酪氨酸溶液、0。3％脯氨酸溶液、0。5％甘氨酸溶液、0.5%苯酚溶液。(3）0.1％茚三酮－乙醇溶液:稱取0。1g茚三酮，溶于100mL95％乙醇。(4）10%NaOH溶液、1％硫酸銅溶液、尿素、濃硝酸.2、儀器：試管及試管夾、酒精燈。四、操作方法1、雙縮脲反應(yīng)(1)取一支干燥試管，加入少量尿素,用微火加熱使之熔化,待熔化的尿素開始變硬時(shí)停止加熱。此時(shí)，尿素已縮合為雙縮脲并放出氨氣（可由氣味辨別）.待試管冷卻，加入約1mL10％NaOH溶液，振蕩使其溶解，再加入1滴1%硫酸銅溶液?；靹蚝笥^察出現(xiàn)的粉紅色.(2）另取1支試管，加入1mL蛋白質(zhì)溶液，再加入2mL10%NaOH溶液搖勻，然后再加入2滴1%的硫酸銅溶液。搖勻觀察其顏色變化.(3)注意事項(xiàng)加入的硫酸銅不可過量，否則會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色的氫氧化銅，從而掩蓋了雙縮脲反應(yīng)的粉紅色。(4）記載上述實(shí)驗(yàn)過程和結(jié)果,并解釋現(xiàn)象.2、茚三酮反應(yīng)(1)取3支試管,分別加入蛋白質(zhì)溶液、0.3％脯氨酸溶液、0.5％甘氨酸溶液各1mL，再加0.5mL0.1％茚三酮－乙醇溶液，混勻后在小火上加熱煮沸1－2min,放置冷卻，觀察顏色變化。(2)在濾紙的不同部位分別滴上一滴0。3％脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液，風(fēng)干后再在原處滴一滴0.1%茚三酮－乙醇溶液，在微火旁烘干顯色，觀察斑點(diǎn)出現(xiàn)及其顏色。(3）記載上述實(shí)驗(yàn)過程和結(jié)果，并解釋現(xiàn)象。3、黃色反應(yīng)向6個(gè)試管中按下表加試劑,觀察現(xiàn)象并記錄。管號材料1234560。5％苯0.3％色氨酸0。3％酪氨蛋白質(zhì)溶液指甲頭發(fā)酚4酸4加入量(滴)濃硝酸（滴）4少許少許442202044酒精燈加熱煮沸現(xiàn)象逐滴加10％NaOH后現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)蛋白質(zhì)是親水膠體，當(dāng)其穩(wěn)定因素被破壞或與某些試劑結(jié)合成不溶性鹽類后，即自溶液中沉淀析出（渾濁現(xiàn)象），此現(xiàn)象叫蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)。（一）蛋白質(zhì)的鹽析作用一、目的意義了解鹽析法及可逆沉淀的原理，學(xué)習(xí)用鹽析法沉淀分離蛋白質(zhì).二、實(shí)驗(yàn)原理鹽析現(xiàn)象是指—般蛋白質(zhì)在高濃度鹽溶液中溶解度下降，故向其溶液中加入中性鹽至一定濃度時(shí)，蛋白質(zhì)即自溶液中沉淀析出。鹽析作用與兩種因素有關(guān):①蛋白質(zhì)分子被濃鹽脫水；②分子所帶電荷被中和。鹽溶現(xiàn)象為低鹽濃度可使蛋白質(zhì)的溶解度增加,實(shí)驗(yàn)時(shí)要加足夠量的鹽。蛋白質(zhì)的鹽析作用是可逆過程,用鹽析方法沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，較少引起蛋白質(zhì)變性，經(jīng)透析或用水稀釋時(shí)又可溶解。三、儀器與試劑1、試劑⑴蛋白質(zhì)溶液:取10mL雞蛋清，用蒸餾水稀釋至100mL，攪拌均勻后用紗布過濾得上清液。⑵飽和硫酸銨溶液；⑶10％氫氧化鈉溶液；⑷1%硫酸銅溶液.四、操作方法1、取蛋白質(zhì)溶液約2mL于試管中,加入過量的飽和硫酸銨溶液,混勻后靜置3分鐘則析出沉淀。（二）重金屬鹽類沉淀蛋白質(zhì)一、目的意義了解重金屬鹽類沉淀法的原理，學(xué)習(xí)用重金屬鹽類沉淀法沉淀分離蛋白質(zhì)。二、實(shí)驗(yàn)原理溶液pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)以上時(shí),重金屬鹽類（如Pb2+、Cu2+、Hg2+及Ag+等）易與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。重金屬鹽類沉淀蛋白質(zhì)通常比較完全，故常用重金屬鹽除去液體中的蛋白質(zhì)。但應(yīng)注意，在使用某些重金屬鹽（如硫酸銅或醋酸鉛)沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，不可過量,否則將引起沉淀再溶解，此時(shí)的溶解為生成憎水膠體的緣故。三、儀器與試劑1、試劑⑴蛋白質(zhì)溶液（與雙縮脲反應(yīng)相同）；⑵5％CuSO4溶液；⑶3％AgNO3溶液。四、操作方法1、取試管2支各加蛋白質(zhì)溶