上游順式作用元件的研究方法

上游順式作用元件的研究方法

mega順式作用元件（Cis-actingelements）指同一DNA分子中具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的特異DNA序列，即具有特殊功能的轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合位點(diǎn)和其他調(diào)控基序。順式作用元件能夠被特異轉(zhuǎn)錄因子識別和結(jié)合，從而影響基因表達(dá)活性。順式作用元件的作用是參與基因表達(dá)的調(diào)控，本身不編碼任何蛋白質(zhì),僅僅提供一個作用位點(diǎn),要與反式作用因子相互作用而起作用。

按功能特性分為通用調(diào)節(jié)元件：啟動子、增強(qiáng)子、沉默子和絕緣子專一性元件：應(yīng)答元件，如激素應(yīng)答元件等啟動子(Promoter)概念：啟動子是基因序列中決定轉(zhuǎn)錄起始的部位。包括核心啟動子和上游啟動子元件。一個基因可同時擁有一個及以上啟動子；一般在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游，位于5‘端上游100-200bp左右，是決定轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄頻率的關(guān)鍵元素；可與增強(qiáng)子共同控制轉(zhuǎn)錄起始和強(qiáng)度；發(fā)揮功能時需RNA聚合酶外，還需轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與啟動子區(qū)各種調(diào)控元件相互作用。由兩部分組成：核心啟動子（CPE)：指保證RNApolⅡ轉(zhuǎn)錄正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-25—-30bp的TATA盒。它單獨(dú)起作用時，只能確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)并產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄；上游啟動子元件（UPE)：包括通常位于-70bp附近的CAAT盒、GC盒等，能通過TFⅡD復(fù)合物調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的頻率，提高轉(zhuǎn)錄效率。增強(qiáng)子(enhancer)

指能夠提高轉(zhuǎn)錄效率、遠(yuǎn)距離調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的上游DNA序列,它間接的把信號從激活因子傳到轉(zhuǎn)錄蛋白。特點(diǎn)：（1）它能通過啟動子大幅度地增加同一條DNA鏈上靶基因轉(zhuǎn)錄的頻率，一般能增加10～200倍，有的甚至可達(dá)千倍。（2）增強(qiáng)子的作用對同源或異源的基因同樣有效，如把SV40的增強(qiáng)子連接到兔β-珠蛋白的基因上，可使轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度增大100倍；（3）增強(qiáng)子的位置可在基因5’上游、基因內(nèi)或其3’下游的序列中，增強(qiáng)效益與其位置和取向無關(guān)；（4）增強(qiáng)子所含核苷酸序列大多為重復(fù)序列，其內(nèi)部含有的核心序列，對于它進(jìn)入到另一宿主之后重新產(chǎn)生增強(qiáng)子效應(yīng)至關(guān)重要；（5）增強(qiáng)子一般都具有組織和細(xì)胞特異性；（6）增強(qiáng)子在DNA雙鏈中沒有5’與3’固定的方向性；（7）增強(qiáng)子可遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，通常在1～4kb（個別情況可達(dá)30kb）外起作用；（8）增強(qiáng)子的活性與其在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的空間方向性有關(guān)。另外，許多增強(qiáng)子還受到外部信號的調(diào)控，如金屬硫蛋白基因的增強(qiáng)子就可對環(huán)境中的鋅、鎘濃度作出反應(yīng)。從機(jī)能上講，沒有增強(qiáng)子存在，啟動子通常不能表現(xiàn)活性；沒有啟動子時，增強(qiáng)子也無法發(fā)揮作用。有時，對結(jié)構(gòu)密切聯(lián)系而無法區(qū)分的啟動子、增強(qiáng)子樣結(jié)構(gòu)統(tǒng)稱啟動子。通常描述的、具有獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄活性和決定基因時間、空間特異性表達(dá)能力的啟動子就是這類定義的啟動子。沉默子(silencer)

是可以抑制基因表達(dá)的順式元件,包括沉默子元件和負(fù)調(diào)控因子(NRE),分別指導(dǎo)主動和被動抑制作用。特點(diǎn)：負(fù)性調(diào)節(jié)元件，與增強(qiáng)子作用相反不受序列方向影響，同時也能遠(yuǎn)距離發(fā)揮作用本身不能實(shí)現(xiàn)衰減作用，必須通過對前導(dǎo)序列的翻譯才能實(shí)現(xiàn)，衰減作用的實(shí)質(zhì)是以翻譯手段控制基因的轉(zhuǎn)錄。絕緣子（Insulator）一種負(fù)調(diào)控元件，參與基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控。干擾增強(qiáng)子與啟動子的相互作用，并抑制啟動子的激活活性。應(yīng)答元件另一類位于基因上游能被轉(zhuǎn)錄因子識別和結(jié)合,調(diào)控基因?qū)Ｒ恍员磉_(dá)的DNA序列。如熱激應(yīng)答元件、激素應(yīng)答元件,cAMP應(yīng)答元件等。應(yīng)答元件含有短重復(fù)序列,不同基因中應(yīng)答元件的拷貝數(shù)相近。蛋白因子結(jié)合在應(yīng)答元件的保守序列上,通常位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游200bp內(nèi)；應(yīng)答元件也有位于啟動子或增強(qiáng)子內(nèi)。研究順式作用元件結(jié)構(gòu)的方法①5’端缺失系列分析法

通過從一側(cè)逐段缺失來確定啟動子的邊界.當(dāng)一段缺失不會阻礙RNA合成,而下一段缺失使轉(zhuǎn)錄不再發(fā)生時,那么我們可以確定啟動子的邊界必然存在于兩者之間.

常用于測定哺乳動物基因調(diào)控區(qū)的上游邊界。爪蟾5SrRNA基因的Ⅲ類啟動子分析實(shí)驗(yàn)操作：首先，確定啟動子的5’端。對爪蟾5SrRNA基因的5’端序列進(jìn)行逐漸缺失，每次缺失序列的長度都會增長，有此獲得5’端長度不等的系列5SrRNA基因突變體，體外觀察突變對基因轉(zhuǎn)錄的影響。通過凝膠電泳測定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的大小，依次判斷轉(zhuǎn)錄的正確與否。該基因的正常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度為120bp。泳道a：未發(fā)生序列缺失的陽性對照泳道b-j：序列缺失后的基因泳道k：陰性對照（pBR322DNA，無

5SrRNA基因序列）5’-序列缺失對5SrRNA基因轉(zhuǎn)錄的影響

②接頭掃描突變法

可以找出存在于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和5’端邊界之間的所有調(diào)控元件方法的基礎(chǔ)是構(gòu)建一系列序列重疊的調(diào)控區(qū)突變體，每個突變體內(nèi)各有一個短序列的核苷酸序列被打亂然后分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞，或微量注入爪蟾卵母細(xì)胞，并分析它們對報告基因的影響接頭掃描突變法機(jī)制對皰疹病毒的胸苷激酶基因啟動子的研究方法：用長度為10bp的接頭對胸苷激酶基因啟動子序列進(jìn)行系統(tǒng)替換，產(chǎn)生不同的突變體，然后將突變DNA分子注入蛙暖母細(xì)胞，同時也注入類似野生型的DNA（在+21至+31處發(fā)生突變），這種野生型突變啟動子與正常野生型啟動子一樣，具有正常的起始轉(zhuǎn)錄活性，可作為內(nèi)參。最后，通過凝膠電泳測定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的大小，