第四章 蛋白質

第一章蛋白質的化學ChemistryofProtein什么是蛋白質(protein)?

由許多氨基酸通過肽鍵相連形成的高分子含氮化合物生物學重要性組成成分參與多種生理功能氧化供能——生命的“執(zhí)行者”第一節(jié)蛋白質的分子組成TheMolecularComponentofProtein一、元素組成主要元素:C、H、O、

、S微量元素:鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬、磷、碘N16%樣品中蛋白質的含量(g%)=樣品含氮克數(shù)×6.25（一）氨基酸結構組成人體蛋白質的氨基酸僅20種α-氨基酸(Pro除外)L-氨基酸(Gly除外)二、氨基酸(aminoacids)αα-氨基酸結構通式

脯氨酸

Pro（亞氨基酸）L-氨基酸的通式RCH3丙氨酸H甘氨酸

（二）氨基酸的分類1.依據(jù)R基團分類非極性氨基酸極性不帶電荷氨基酸帶負電荷氨基酸帶正電荷氨基酸非極性疏水性氨基酸甘氨酸

glycine

Gly

G

丙氨酸

alanineAlaA

纈氨酸

valineValV

亮氨酸

leucine

LeuL

異亮氨酸

isoleucineIleI

苯丙氨酸

phenylalaninePheF

脯氨酸

prolineProP

色氨酸

tryptophanTryW

絲氨酸

serineSerS

酪氨酸

tyrosineTryY

半胱氨酸

cysteine

CysC

蛋氨酸

methionine

MetM

天冬酰胺

asparagine

AsnN

谷氨酰胺

glutamineGlnQ

蘇氨酸

threonine

ThrT2.極性中性氨基酸天冬氨酸

asparticacidAspD

谷氨酸

glutamicacidGluE

賴氨酸

lysineLysK

精氨酸

arginine

ArgR

組氨酸

histidineHisH

3.酸性氨基酸4.堿性氨基酸特殊分類含硫：Cys、Met含酰胺：Asn、Gln含羥基：Ser、Thr、Tyr芳香族：Phe、Tyr、Trp支鏈：Val、Leu、Ile含胍基——Arg；含咪唑基——His

含吲哚基——Trp

（二）氨基酸的分類（二）氨基酸的分類按營養(yǎng)需要營養(yǎng)必需氨基酸營養(yǎng)非必需氨基酸Met、Val、Lys、IlePhe、Leu、Trp、Thr

特殊氨基酸+-HH胱氨酸二硫鍵第二節(jié)蛋白質的分子結構TheMolecularStructureofProtein若讓你研究一個未知蛋白質的結構，你最先想弄清什么？隨后你該如何由簡單到復雜地研究？一級結構二級結構三級結構四級結構空間構象一、一級結構1.定義蛋白質分子中氨基酸的連接方式、排列順序和二硫鍵所在的位置2.維系鍵肽鍵,有些包括二硫鍵3.肽鍵(peptidebond)

由一個氨基酸的-羧基與另一個氨基酸的-氨基脫水縮合而形成的化學鍵+-HOH甘氨酰甘氨酸肽鍵4.肽(peptide)由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽……十個以內(nèi)氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全，被稱為氨基酸殘基(residue)多肽鏈的書寫與命名書寫：一般叢N末端向C末端書寫，書寫多肽鏈時可用略號，N端寫于左側，用H做標幟，C端于右側用OH表示。肽詳細命名：某某酰某某?！衬乘帷?/p>

蘇氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸

Ala-Gly-Pro-His和His-Pro-Gly-Ala是否為同一物質？

5.一級結構的測定氨基酸的組成氨基酸的排列順序氨基酸組成的分析樣品純化（均一）確定多肽鏈數(shù)N末端分析C末端分析完全水解氨基酸測定

N末端分析方法二硝基氟苯法（DNFB）二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl）Edman降解法氨肽酶法

DNFB法蛋白質（多肽）A+DNFBDNP蛋白質（多肽）A氨基酸DNPA

Edman

降解法蛋白質（多肽）A+PITCPTC蛋白質（多肽）APTHA蛋白質（多肽）

C末端分析方法肼解法羧肽酶法A:脂肪族或芳香族B:堿性氨基酸C:ProY:各種C端氨基酸氨基酸順序的測定蛋白質（多肽）裂解酶解法化學法肽譜重疊分析酶解法（內(nèi)肽酶）LysArg

aa

Phe

Trp

Tyr疏水a(chǎn)a

疏水a(chǎn)a

胰蛋白酶

糜蛋白酶胰凝乳蛋白酶

胃蛋白酶

化學法溴化氰Met（羧基肽鍵）羥胺Asn—Gly（Leu；Ala）例題今有一個七肽，經(jīng)分析氨基酸組成為Lys

、Pro、Arg、Phe、Ala、Tyr和Ser。此肽未經(jīng)糜蛋白酶處理時，與FDNB反應不產(chǎn)生-DNP-氨基酸。經(jīng)糜蛋白酶作用后為兩個肽段，分別為Ala、Tyr、Ser和Pro、Phe、Lys、Arg。此肽段分別與FDNB反應，可分別產(chǎn)生DNP-Ser和DNP-Lys。若與胰蛋白酶反應也生成兩段肽，分別為Arg、Pro和Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala。試問此七肽的一級結構怎樣？氨基酸序列分析分析已純化蛋白質的氨基酸殘基組成測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基把肽鏈水解成片段，分別進行分析測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用Edman降解法一般需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經(jīng)過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結果。通過核酸來推演蛋白質中的氨基酸序列分離編碼蛋白質的基因測定DNA序列排列出mRNA序列按照三聯(lián)密碼的原則推演出氨基酸的序列二、空間構象（一）定義蛋白質分子中原子和基團在三維空間

上的排列。主鏈構象側鏈構象二、空間構象（二）維系鍵：次級鍵氫鍵范德華力疏水鍵離子鍵二硫鍵二、空間構象空間構象按的范圍及復雜度分為二級結構三級結構四級結構

（三）二級結構1.定義指蛋白質分子中某段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側鏈的構象2.維系鍵氫鍵肽平面肽平面成為肽鏈盤曲折疊的基本單位

肽鏈以肽平面為單位可形成幾種構型?α-螺旋β-折疊β-轉角無規(guī)則卷曲

-螺旋-螺旋結構特點右手螺旋每3.6個氨基酸殘基上升一圈，相當于0.54nm每一個氨基酸殘基中的NH和前面相隔三個殘基的C＝O之間形成氫鍵側鏈R分布在螺旋外側，其形狀、大小及電荷影響α－螺旋的形成-折疊-折疊結構特點肽鏈相當伸展，肽平面之間折疊成鋸齒狀，相鄰肽平面間呈110°角。氨基酸殘基的R側鏈伸出在鋸齒的上方或下方。兩條肽鏈或一條肽鏈內(nèi)的兩段肽鏈間的C＝O與H形成氫鍵兩段肽鏈可以是平行的，也可以是反平行的.正、反平行能相互交替,平行的結構中，兩個殘基的間距為0.65nm；反平行的結構，則間距為0.7nm。

β-轉角四個AA殘基的1位-CO-與4位-NH-形成氫鍵,造成180°回折,其封閉環(huán)含10個原子無規(guī)卷曲是用來闡述沒有確定規(guī)律性的那部分肽鏈結構。

(四)超二級結構（基序）1.定義在許多蛋白質分子中，可發(fā)現(xiàn)兩個或兩個以上具有二級結構的肽段，在空間上相互接近，形成一個有規(guī)則的二級結構組合2.組合形式

；；

(四)超二級結構3.模體(motif)是具有特殊功能的超二級結構，它是由兩個或三個具有二級結構的肽段，在空間上相互接近，形成一個特殊的空間構象。鈣結合蛋白中結合鈣離子的模體鋅指結構

（五）三級結構1.定義整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置.2.維系鍵次級鍵肌紅蛋白(Mb)N端

C端

3.結構域(domain)在分子量較大的蛋白質分子中，多肽鏈上相鄰的超二級結構緊密聯(lián)系，進一步折疊成一個或多個相對獨立的致密區(qū)域，并各行使功能。

（六）四級結構1.亞基(subunit)有些蛋白質分子含有二條或多條多肽鏈每一條多肽鏈都有完整的三級結構，稱為亞基

。2.四級結構蛋白質分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為四級結構。3.維系鍵氫鍵和離子鍵

血紅蛋白(Hb)第三節(jié)蛋白質結構與功能的關系TheRelationofStructureandFunctionofProtein

一、一級結構與功能的關系1.一級結構是空間結構的基礎天然狀態(tài)，有催化活性尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性去除尿素、β-巰基乙醇

2.一級結構不同，生物學功能各異加壓素Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly

縮宮素Cys-Tyr-Leu-Gln-Asn-Cys-Pro-Ile-Gly

收縮血管，升高血壓，抗利尿子宮收縮，催產(chǎn)功能

3.一級結構相似的蛋白質，其基本構象及功能也相似垂體前葉分泌的促腎上腺皮質激素(ACTH)和促黑激素(α-MSH,β-MSH)共有一段相同的氨基酸序列，因此，ACTH也可促進皮下黑色素生成，但作用較弱-甲硫-谷氨-組氨-苯丙氨-精氨-色氨-甘氨4.在蛋白質的一級結構中，參與功能活性部位的殘基或處于特定構象關鍵部位的殘基，即使在整個分子中發(fā)生一個殘基的異常，那么該蛋白質的功能也會受到明顯的影響。鐮刀形紅細胞貧血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbS

β肽鏈HbA

β肽鏈N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)

二、空間構象與功能的關系蛋白質多種多樣的功能與各種蛋白質特定的空間構象密切相關，蛋白質的空間構象是其功能活性的基礎，構象發(fā)生變化，其功能活性也隨之改變。

1.蛋白質變性蛋白質變性時，由于其空間構象被破壞，故引起功能活性喪失，變性蛋白質在復性后，構象復原，活性即能恢復。天然狀態(tài)，有催化活性尿素、β-巰基乙醇去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性

2.變構效應(allostery)小分子物質與蛋白質分子結合，導致其構象改變，并伴隨其功能的變化，稱為變構效應或別構作用。蛋白激酶PKARRCC

無活性

cAMP

有活性

3.蛋白質構象改變與疾病若蛋白質的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結構不變，但蛋白質的構象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導致疾病發(fā)生。有些蛋白質錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質淀粉樣纖維沉淀的病理改變。

瘋牛病朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)正常PrPc瘋牛病PrPsc第四節(jié)蛋白質的性質TheCharactersofProtein

一、蛋白質分子大小、形狀和

分子量的測定分子大?。?×104～106

Da形狀：分子量測定方法不對稱常數(shù)≈

1球形＞

1纖維狀之間橢圓形分子篩層析法SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳生物質譜

二、蛋白質變性(denaturation)1.定義在某些物理和化學因素作用下，特定的空間構象被破壞,從而導致其理化性質改變和生物活性的喪失。2.本質次級鍵破壞，不涉及一級結構的變化3.因素加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等

4.應用舉例臨床醫(yī)學上，變性因素常被應用來消毒及滅菌高溫蒸煮、照射紫外線、噴灑苯酚溶液、在傷口處涂抹酒精溶液等化驗室，用加熱凝固的方法檢查尿中的蛋白質，如有，尿液變渾濁有機汞等重金屬離子中毒時，可喝牛奶解其毒性保存蛋白質制劑（防止變性）:酶，疫苗，免疫血清，避免蛋白質變性，以防失活

5.變性蛋白改變的理化性質溶解度降低粘度增加結晶性破壞生物學活性喪失易被蛋白酶分解

6.復性(renaturation)變性并非是不可逆的變化，當變性程度較輕時，如去除變性因素，有的蛋白質仍能恢復或部分恢復其原來的構象及功能，變性的可逆變化稱為復性。

三、蛋白質的兩性電離和等

電點CHNH3+COO-RCHNH3+COO-R+H++OH-CHNH2COO-RCHNH2COO-RpH>pI陰離子pH=pI氨基酸的兼性離子

+OH-+H+CHCOOHRNH3+CHCOOHRNH3+pH<pI陽離子1.氨基酸的兩性解離2.蛋白質可解離部分兩端的游離氨基和羧基側鏈中一些解離基(Glu、Asp、

Lys、

Arg和His)

3.蛋白質的等電點當?shù)鞍踪|溶液處于某一pH時，蛋白質解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質的等電點4.判斷依據(jù)

pH＞pI

負

pH＝pI

零

pH＜pI

正凡堿性氨基酸含量較多的蛋白質，等電點就偏堿性凡酸性氨基酸含量較多的蛋白質，等電點就偏酸性思考

?一多肽為Ala-Arg-Gly-His-Arg-His-Ala-Arg-His,問當溶液pH值為7.0時.此多肽向電場哪極移動?答案:負Glu-His-Arg-Val-Lys-Asp肽段電泳時,在哪種pH下移向負極?()A.12B.3C.11D.5E.9

答:BD

四、膠體性質分子量頗大，介于一萬到百萬之間分子的大小已達到膠粒1～100nm范圍之內(nèi)膠體穩(wěn)定的因素顆粒表面電荷水化膜

五、蛋白質沉淀(precipitation)1.定義蛋白質分子凝聚從溶液中析出的現(xiàn)象本質水化膜和電荷因素被去除3.與蛋白質變性區(qū)別變性蛋白質一般易于沉淀，但也可不變性而使蛋白質沉淀，在一定條件下，變性的蛋白質也可不發(fā)生沉淀+++++++帶正電荷的蛋白質在等電點的蛋白質－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質水化膜酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用++++++++帶正電荷的蛋白質－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質不穩(wěn)定的蛋白質顆粒酸堿溶液中蛋白質的聚沉

4.蛋白質沉淀方法中性鹽沉淀法有機溶劑沉淀法加熱沉淀法重金屬鹽沉淀法生物堿沉淀法中性鹽沉淀法鹽溶作用低鹽濃度可使蛋白溶解度增加的現(xiàn)象。鹽析作用高鹽濃度時，因破壞蛋白質分子表面的水化膜并中和電荷，而使蛋白質分子相互聚集從溶液中析出的現(xiàn)象。特點:沉淀蛋白不變性。有機溶劑沉淀機理破壞水化膜特點可引起蛋白變性丙酮沉淀而不變性的條件0～4℃低溫，10倍體積，立即分離

六、呈色反應茚三酮反應(NinhydrinReaction)加熱時，產(chǎn)生藍紫色反應雙縮脲反應(BiuretReaction)肽鍵反應，產(chǎn)生紫紅色酚試劑反應酪氨酸，產(chǎn)生藍色第五節(jié)蛋白質的分離純化TheSeparationandPurificationofProtein提取分離純化分析鑒定蛋白質分離純化的方法（一）依據(jù)溶解度不同等電點沉淀鹽析沉淀低溫有機溶劑沉淀蛋白質分離純化的方法（二）依據(jù)分子大小不同透析與超濾密度梯度離心凝膠過濾

1.透析與超濾透析利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法超濾應用正壓或離心力使蛋白質溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質溶液的目的思考題將分子量分別為a（90000）、b（45000）和c（110000）的3種蛋白混合液過凝膠柱，洗脫順序是

cab

3.超速離心既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量蛋白質在離心場中的行為用沉降系數(shù)(sedimentationcoefficient,S)表示,沉降系數(shù)與蛋白質的密度和形狀相關因為沉降系數(shù)S大體上和分子量成正比關系，故可應用超速離心法測定蛋白質分子量，但對分子