生物固定技術(shù)

生物分子固定化技術(shù)及應(yīng)用―—載體、活化2014.06.23載體對(duì)載體的要求：1、表面具有化學(xué)活性基團(tuán)2、具備一定的容量3、惰性好4、良好的生物相容性5、足夠的穩(wěn)定性6、合適的粒度和孔徑結(jié)構(gòu)（親和色譜）7、廉價(jià)易得載體材料類(lèi)型：無(wú)機(jī)載體材料天然有機(jī)高聚物合成有機(jī)高聚物膜磁性微球無(wú)機(jī)載體材料：硅膠：機(jī)械強(qiáng)度好、容量高，但PH穩(wěn)定性差、殘余的硅醇羥基可造成非特異性吸附可控孔玻璃（CPG）：質(zhì)地硬、孔徑均勻、重復(fù)性好、不易受腐蝕，但未經(jīng)修飾的CPG對(duì)蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的非特異性吸附玻碳材料：化學(xué)穩(wěn)定性高，熱脹系數(shù)小，質(zhì)地堅(jiān)硬，氣密性好，電勢(shì)適用范寬其他:金、鉑、氧化鋁等等天然有機(jī)高聚物：纖維素：廉價(jià)、穩(wěn)定性好，但易受PH及離子強(qiáng)度影響瓊脂糖凝膠：良好的惰性、非特異性吸附低、易活化、容量高，但機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性差葡聚糖凝膠：交聯(lián)度可控、可耐高溫、可活化羥基多，是完整細(xì)胞分離的理想載體脂質(zhì)體：生物相容性好，導(dǎo)向性好微生物表面呈觀：使用基因工程的方法以活微生物作載體將蛋白質(zhì)分子表達(dá)于微生物表面其他：如變性膠原微載體―培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，白蛋白微球―制備載體藥物合成有機(jī)高聚物：丙烯酰胺衍生物：化學(xué)穩(wěn)定性好、抗微生物侵蝕、非特異性吸附低，但機(jī)械穩(wěn)定性差、網(wǎng)孔過(guò)小甲基丙烯酸衍生物：機(jī)械和化學(xué)穩(wěn)定性好，其中聚甲基丙烯酸羥乙酯還可作為細(xì)胞培養(yǎng)的微載體聚苯乙烯類(lèi)：抗原抗體可通過(guò)疏水吸附包被在聚苯乙烯微孔板上，是非均相免疫分析中普遍使用的免疫反應(yīng)劑和分離劑，但對(duì)小分子肽物理吸附效果差聚四氟乙烯（塑料王）：化學(xué)穩(wěn)定性極強(qiáng)、不溶于水和有機(jī)溶劑、耐熱其他：聚酰胺、聚乙烯醇、聚氨基甲酸酯等在生物傳感探頭的制備中具有重要作用磁性微球：一種特殊的生物固定化載體，可用于細(xì)胞分離、基因操作、免疫分析及固定化酶等領(lǐng)域，由于其顆粒較小，因而可在體系中穩(wěn)定的懸浮，易于進(jìn)行親和性結(jié)合或進(jìn)行催化反應(yīng);順磁性使其固液分離更加操作方便。3個(gè)評(píng)價(jià)磁珠性能的方面：懸浮穩(wěn)定性與順磁性表面性能，必須有足夠的化學(xué)活性基團(tuán)用來(lái)偶聯(lián)，此外，表面性能如Zeta電位、表面疏水性及水化層厚度等也直接影響其性質(zhì)均一性，保證各磁性微球?qū)ν獯艌?chǎng)響應(yīng)的同步性、生物分子偶聯(lián)容量的穩(wěn)定性和實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性磁性材料：Fe、Co、Ni等過(guò)渡金屬特定晶型的氧化物和混合氧化物及水化物活化活化方法的原則：活化方法應(yīng)能防止結(jié)合到載體上配基的漏失沒(méi)有非特異性吸附載體的產(chǎn)生不應(yīng)改變載體的性質(zhì)產(chǎn)生快速有效的配基偶聯(lián)活化方法容易進(jìn)行活化方法具有可重復(fù)性幾種常見(jiàn)基團(tuán)的活化方法：氨基活化巰基活化羰基活化羥基活化活潑氫的活化光交聯(lián)反應(yīng)氨基活化方法：溴化氰（CNBr）法N-羥基琥珀酰亞胺酯（NHS）活化法羰基二咪唑（CDI）活化法還原氨化法FMP活化法碳二亞胺（EDC）法有機(jī)磺酰氯法二乙烯基砜（DVS）法吖內(nèi)酯法氰尿酰氯（TST）法溴化氰法：用于含羥基載體，可偶聯(lián)小配基，操作簡(jiǎn)單也容易重復(fù)，偶聯(lián)蛋白時(shí)比較溫和；有少量持續(xù)的偶聯(lián)配基脫落N(xiāo)-羥基琥珀酰亞胺酯（NHS）活化法：可用來(lái)活化瓊脂糖凝膠、金箔電極和載體偶聯(lián)配基N,N’-琥珀酰亞胺酸酯（DCS）碳二亞胺（EDC）法：加速羧酸和氨基之間酰胺鍵的形成，是零長(zhǎng)度交聯(lián)劑，廣泛應(yīng)用于偶聯(lián)反應(yīng)巰基活化方法：碘乙酰和溴乙?；罨R來(lái)酰亞胺法吡啶二硫化物法二乙烯基砜法環(huán)氧法TNB-硫醇活化法碘乙酰和溴乙酰活化法：馬來(lái)酰亞胺法：廣泛的用作加速蛋白質(zhì)或多肽中的巰基共軛交聯(lián)，通常馬來(lái)酰亞胺在一個(gè)雙功能交聯(lián)劑的一端，通過(guò)兩步反應(yīng)把蛋白質(zhì)的功能基結(jié)合到另一個(gè)巰基上羰基活化方法：酰肼活化法還原氨化法酰肼活化法：含醛或酮基的配基與酰肼的偶聯(lián)是通過(guò)穩(wěn)定的腙鍵形式，該方法還可固定糖蛋白還原氨化法：對(duì)直接共價(jià)結(jié)合脂肪醛、酮、還原糖或蛋白質(zhì)的氨基具有多向選擇性羥基活化方法：環(huán)氧化物活化方法二乙烯基砜（DVS）法氰尿酰氯法環(huán)氧化物（二環(huán)氧乙烷）活化方法：二環(huán)氧乙烷能在羥基聚合物中引入環(huán)氧乙烷基，1,4-丁二醇二縮水甘油醚經(jīng)常用來(lái)導(dǎo)入這些基團(tuán)，廣泛的用于偶聯(lián)單糖和低聚糖以及含有仲胺的配基活潑氫的活化方法：偶氮反應(yīng)曼尼期縮合法偶氮反應(yīng)：偶氮衍生物能夠同帶有酚羥基或咪唑基團(tuán)反應(yīng)，快速的產(chǎn)生可逆的偶氮鍵，活化載體通常是從手臂分子末端的對(duì)氨基苯烷基團(tuán)開(kāi)始制備光交聯(lián)反應(yīng)：芳環(huán)偶氮基團(tuán)