引物合成常規(guī)問題

Q1.引物是怎樣合成的？當(dāng)前引物合成基本采納固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有好多種,不論采納什么機(jī)器合成，合成的原理都相同，主要差別在于合成產(chǎn)率的高低，試劑耗費(fèi)量的不同和單個(gè)循環(huán)用時(shí)的多少。(1)??去保護(hù)：加入Deblocking脫去堿基上5'-OH的保護(hù)基團(tuán)DMT，獲取游離的5'-OH；?(2)??耦合：同時(shí)加入活化劑和新的堿基，新的堿基5'-OH仍舊被DMT保護(hù)，3'端被活化與溶液中游離的5'-OH發(fā)生耦合反響；(3)??關(guān)閉：耦合反響中很少量5'-OH沒有參加反響，用關(guān)閉試劑停止此后持續(xù)發(fā)生反響；(4)??氧化：加入氧化劑使其由核苷亞磷酸酯形成更牢固的核苷磷酸酯。Q2.引物合成后怎樣辦理？切割與脫保護(hù)基：將合成好的寡核苷酸鏈從支持物上化學(xué)切割下來。常用新鮮的濃氨水來裂解CPG與初始核苷之間的酯鍵。斷裂下來的寡核苷酸帶有自由的3’羥基。純化：依據(jù)所合成寡核苷酸的組成和應(yīng)用來選定純化的方法。常用的純化方法有：C18、OPC、PAGE和HPLC。定量：依據(jù)寡核苷酸在260nm處的紫外吸取來定量。積蓄：分裝抽干。Q3.需要什么級其他引物？依據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，確立訂購引物的純度級別。應(yīng)用????引物長度要求????純度級別要求一般PCR擴(kuò)增????<60base????HEPD????>60base????PAGE診療PCR擴(kuò)增????<40base????HEPD,PAGEDNA測序????20base左右????HEPD亞克隆，點(diǎn)突變等????依據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定????HEPD,PAGE，HPLC基因建立（全基因合成）????依據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定????HEPDPAGE反義核酸????依據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定????HEPDPAGE修飾引物????依據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定????PAGE,HPLCQ4.引物的質(zhì)量是否是跟序列有關(guān)？四種堿基的性質(zhì)和各自保護(hù)基的性質(zhì)都有差別。因此合成難度是不相同的。難度最大的當(dāng)屬GC重復(fù)多的和序列中還有多個(gè)連續(xù)的G的引物。特別關(guān)于后者，國內(nèi)企業(yè)一般都做不了20個(gè)G以上的引物。實(shí)考證明，假如引物中有超出三個(gè)連續(xù)G的構(gòu)造，傳統(tǒng)方法獲取的產(chǎn)物質(zhì)量就會開始降落。并且當(dāng)前通用的脫鹽、OPC和PAGE方法都無效。鼎國鼎盛生物企業(yè)擁有的HEPD專利技術(shù)可以戰(zhàn)勝高GC或許高G含量引物的合成和純化阻攔，對一般引物、高GC引物和不論長短的oligod（G）都能獲取相同的特別好的結(jié)果。Q5.需要合成多少OD數(shù)？依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)看_實(shí)定。一般PCR擴(kuò)增，2OD引物，可以做500-1000次50ul標(biāo)準(zhǔn)PCR反響。假如是做基因拼接或退火后做連結(jié)，1OD就足夠了。Q6.怎樣計(jì)算引物的濃度？引物保留在高濃度的狀況下比較牢固。一般狀況下，我們建議將引物的濃度配制成100pmol/ul，稱為保留濃度，而引物的工作濃度一般配制成10-50pmol/ul。加水的體積（微升）可直接參照合成報(bào)告單上介紹的體積，也可按以下方式計(jì)算：V(微升)=OD數(shù)x33x10000/引物的分子量引物的分子量可以從合成報(bào)告單上獲取。注意：1OD260=33ug/ml。Q7.怎樣計(jì)算引物的Tm值？引物設(shè)計(jì)軟件都可以給出Tm，與引物長度、堿基組成及所使用緩沖夜的離子強(qiáng)度有關(guān)。長度為25base以下的引物，Tm計(jì)算公式為：Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T)關(guān)于更長的寡聚核苷酸，Tm計(jì)算公式為：Tm=81.5+16.6xLog10[Na+]+0.41(GC%)–600/size＊＊公式中，Size=引物長度。Q8.引物（含修飾）的分子量是怎樣確立的？非修飾的引物的分子量（MW）在隨引物供給的報(bào)告單上可以找到。假如需要預(yù)計(jì)一個(gè)引物的分子量按每個(gè)堿基的平均分子量為324.5，引物的分子量=堿基數(shù)x堿基的平均分子量，或按以下公式計(jì)算MW=(NA*WA)+(NC*WC)+(NG*WG)+(NT*WT)+(Nmod*Wmod)＋(Nx*Wx)+(NI*WI)+16*Ns–62.NA,NG,NC,NT,NI分別為引物中堿基A或G或C或T或I的數(shù)目，WA,WG,WC,WT,WI分別為引物中堿基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod分別為修飾基團(tuán)的數(shù)目和分子量。關(guān)于混淆堿基的分子量為混淆堿基的分子量總合除以混淆數(shù)，比方G+A混淆的分子量為（313.21+329.21）/2=321.21。Ns為硫代數(shù)目，硫代每個(gè)地點(diǎn)增添分子量16。常例堿基分子量Base????MolecularWeightA????313.21C????289.18G????329.21T????304.19I????314.2U????290.17常例修飾基團(tuán)分子量5’-Biotin????405.45????3’-TAMARA????623.605’-(6FAM)????537.46????3’-Dabsyl????498.495’-HEX????744.13????3’-(6FAM)????569.465’-TET????675.24????3’-AminoModifierC3????153.075’-Cy5????533.63????3’-AminoModifierC7????209.185’-Cy3????507.59????3’-ThiolModifierC3????154.12Q9.怎樣溶解引物？干燥后的引物質(zhì)地特別松散，開蓋前最好剎時(shí)離心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，將引物粉末采集到管底。依據(jù)計(jì)算出的體積加入去離子無菌水或TE(pH8.0)緩沖液，室溫放置幾分鐘，振蕩助溶，離心將溶液采集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水，因?yàn)橛行┱麴s水的pH值比較低（pH4-5）,引物在這類條件下不牢固。Q10.怎樣保留引物？引物合成后，經(jīng)過一系列辦理和純化步驟，旋轉(zhuǎn)干燥而成無色或白色絮狀干粉。干??粉：運(yùn)輸經(jīng)常溫運(yùn)輸，-20℃可以保留一年。積蓄液：配好后分裝成幾管，防備頻頻凍融，-20℃可以保留半年。工作液：常例使用，4℃保留，也可-20℃保留，但應(yīng)防備頻頻凍融。修飾熒光引物：需要避光保留，趕快使用為宜。Q11.最長可以合成多長的引物？我們合成過100base的引物，可是產(chǎn)率很低。除非需要，建議合成片段長度不要超出80base。引物越長，出現(xiàn)問題的概率就越大，依據(jù)當(dāng)前的引物合收效率，大于80base的粗產(chǎn)品，全長引物的百分比不高，后續(xù)辦理還有扔掉好多，最后的產(chǎn)量很低。Q12.為何修飾引物的產(chǎn)量要比一般引物低，價(jià)錢要高?主要因?yàn)槭切揎梿误w牢固性較差，偶連時(shí)間長，效率低，最后獲取的產(chǎn)量自然低于一般的引物。修飾引物平時(shí)需要PAGE或HPLC純化，純化過程損失大。修飾引物使用的原料是一般引物原料的幾百倍，因此產(chǎn)品的價(jià)錢也高。Q13.引物片段退火后不可以連結(jié)到載體上是什么問題？連結(jié)反響需要引物的5’磷酸基團(tuán)。假如需要將合成的引物退火直接連結(jié)相應(yīng)的載體上，引物需要磷酸化。磷酸化的產(chǎn)物假如還不可以連結(jié)載體上，需要檢查載體的酶切收效，需要改良引物退火的條件。SiRNA分子擁有特其他對稱構(gòu)造，退火的難度較大，退火時(shí)需要提升退火溫度。Q14.為何引物的OD260/OD280小于1.5？需要指出的是OD260/OD280的比值不可以用來權(quán)衡引物的純度。OD260/OD280的比值過低一般是因?yàn)橐镏蠧/T的含量比較高所致。下表是一個(gè)20base同聚體引物的OD260/OD280的比值，清楚表示OD260/OD280的比值與引物的堿基構(gòu)成婚密有關(guān)。A260/280ratiosofCrude20-merOligosofDifferingBaseCompositionsBaseComposition????A260/2805-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3????2.505-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3????1.855-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3????1.155-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3????1.145-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3????1.66Q15.相同的OD用PAGE檢測，EB染色為何深淺不一？平時(shí)可以用EB染色的方法來判斷雙鏈DNA的量(如質(zhì)粒DNA)，因?yàn)镋B可以嵌合到雙鏈DNA中。而合成的單鏈DNA，因?yàn)閴A基組成不同，形成二級構(gòu)造的可能性不同，EB的染色程度也會有差別，比方Oligo(dT)等不形成二級構(gòu)造，EB染色收效就特別差。因此不要用EB染色的方法來定量，而用紫外分光光度計(jì)檢測。Q16.怎樣檢測引物的純度？實(shí)驗(yàn)室方便的做法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。取的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增添樣品比重，簡單加樣。600V電壓進(jìn)行電泳，一準(zhǔn)時(shí)間后(約2-3小時(shí))，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。假如條件允許，也可以用銀染方式染色。Q17.已經(jīng)溶解的引物，為何原來使用正常，而過一