RNAi-2006諾貝爾生理學(xué)獎或醫(yī)學(xué)獎

內(nèi)容摘要一、獲獎?wù)吆喗槎NAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)三、RNAi現(xiàn)象的分子機(jī)理四、RNAi的應(yīng)用第一頁，共22頁。一、獲獎?wù)吆喗榘驳卖敗し?AndrewZ.Fire），美國科學(xué)家、生物醫(yī)學(xué)家。1959年出生于美國，1983年獲美國麻省理工學(xué)院生物學(xué)博士學(xué)位，現(xiàn)任斯坦福醫(yī)學(xué)院病理學(xué)和遺傳學(xué)教授。主要研究方向?yàn)榧?xì)胞和組織對遺傳改變的反應(yīng)機(jī)制。

克雷格·梅洛（CraigC.Mello),1960年出生，1990年獲得哈佛大學(xué)生物學(xué)博士學(xué)位，現(xiàn)任美國馬薩諸塞州大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)教授。主要研究方向是胚胎發(fā)生早期細(xì)胞進(jìn)行分化的機(jī)制?，F(xiàn)在Mello實(shí)驗(yàn)室的研究方向?yàn)镽NAi和胚胎發(fā)育。第二頁，共22頁。諾貝爾獎評審委員會的公報中稱：“他們的發(fā)現(xiàn)澄清了許多令人迷惑和矛盾的試驗(yàn)結(jié)果。揭開了大自然控制遺傳信息傳遞的一種基本機(jī)制，他們開創(chuàng)了一個嶄新的研究領(lǐng)域?！狈柡兔仿瀚@獎是因?yàn)樗麄儭鞍l(fā)現(xiàn)了控制遺傳信息流動的基本機(jī)制”，這一機(jī)制為控制基因信息提供了基礎(chǔ)性的依據(jù)。公報指出，RNAi已被廣泛用作研究基因功能的一種手段，并有望在未來幫助科學(xué)家開發(fā)出治療疾病的新療法。第三頁，共22頁。二、RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)1、1990年，為加深矮牽?；?penmias)的紫色，Jorgensen等導(dǎo)入了一個強(qiáng)啟動子控制的色素基因。可是結(jié)果與預(yù)期相反，許多花瓣顏色并未加深，反而呈雜色甚至白色。這是由于轉(zhuǎn)基因和同源的內(nèi)源基因的表達(dá)都被抑制了，Jorgensen把這個現(xiàn)象命名為共抑制(cosuppression)。2、1992年，Romano和Macino在脈孢霉進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究時,發(fā)現(xiàn)了存在于真菌中的類似現(xiàn)象，他們稱之為基因抑制(quelling)。這一現(xiàn)象后來在其它真菌中也相繼被發(fā)現(xiàn)。3、1995年，康奈爾大學(xué)的SuGuo在用反義RNA(antisense

RNA)阻斷秀麗隱桿線蟲基因表達(dá)的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，反義RNA和正義RNA(senseRNA)都阻斷了基因的表達(dá)，都具有很高的基因沉默活性。當(dāng)時他們對這個結(jié)果感到十分困惑。RNAi發(fā)現(xiàn)歷史第四頁，共22頁。4、1998年，AndrewFire和CraigC.Mello等的研究證明，在正義RNA阻斷了基因表達(dá)的試驗(yàn)中，真正起作用的是雙鏈RNA,同時包含了正義鏈和反義鏈的雙鏈RNA(double—strandedRNA，dsRNA)阻斷基因表達(dá)的效果要比單獨(dú)注射正義鏈或者反義鏈強(qiáng)得多。Fire和Mello把他們的結(jié)果發(fā)表在1998年2月19日的《Nature》雜志上，他們的發(fā)現(xiàn)澄清了此前一系列令人們感到困惑的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，并且揭示出了一種遺傳信息流動的控制機(jī)制。．帶有肌肉蛋白編碼信息的RNA被注射到秀麗隱桿線蟲體內(nèi)．單鏈RNA沒有產(chǎn)生任何效果．但當(dāng)雙鏈RNA注射之后，線蟲開始抽搐，這是一種類似于攜帶有肌肉蛋白缺陷型基因的線蟲所表現(xiàn)出的表型．第五頁，共22頁。第六頁，共22頁。第七頁，共22頁。三、RNAi現(xiàn)象分子機(jī)理1、基本概念：RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的一種現(xiàn)象，它是指當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA(double-standedRNA，dsRNA)時，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)。第八頁，共22頁。2、分子機(jī)理：在RNAi起始階段，長鏈dsRNA結(jié)合到一個特異的內(nèi)切酶Dicer上，并被Dicer切割成21-23nt小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。然后，另外一種蛋白復(fù)合物RISC(RNAInducingSilencingComplex，包含了雙鏈RNA解旋所必需的蛋白)與這些siRNA結(jié)合在一起。siRNA分子的一條鏈被去掉，但另外一條鏈結(jié)合在RISC復(fù)合物上作為一個探針去識別mRNA分子。當(dāng)一個mRNA分子可以和RISC復(fù)合物上的RNA片段配對時，它就結(jié)合到復(fù)合物上,在距離3'端12個堿基處切割靶向mRNA,從而引起轉(zhuǎn)錄后基因沉默。第九頁，共22頁。FirststepdsRNAisdigestedinto21-23siRNAsbyDicer(MemberofRNaseIIIfamily)Secondstep:siRNAsbindtoRISC(RNAInducingSilencingComplex)ActiveRISCTargetshomologoustranscriptCleavesthem12ntfrom3’endofsiRNAMechanismofcleavage:unclearRISCcomposition:singlesiRNA,RNaseThirdstep:

第十頁，共22頁。3、該技術(shù)有3個重要特點(diǎn)：第一，它具有高效性。從剛開始的21~23個核苷酸小干擾RNA分子，到后來研究應(yīng)用的小發(fā)夾RNA分子，都具有高效抑制作用，抑制率在90%以上；第二，有嚴(yán)格的序列特異性針對變異基因設(shè)計的RNA分子抑制異?；?，而正常基因不受影響；第三，具有高度的穩(wěn)定性?；瘜W(xué)性質(zhì)很穩(wěn)定，不需要修飾。第十一頁，共22頁。四、RNAi的應(yīng)用1、RNAi是抵抗病毒、保持基因組穩(wěn)定性、抑制跳躍基因的防御系統(tǒng)

跳躍基因也叫轉(zhuǎn)座子，是一些在基因組中可以移動的DNA序列。它們存在于所有的生物體內(nèi)，如果他們移動至錯誤的地方就會給機(jī)體造成損傷。很多轉(zhuǎn)座子復(fù)制它們的DNA到RNA，然后再反轉(zhuǎn)錄回DNA，插入到基因組中的另外一個位置。這些RNA分子有一部分是雙鏈的，可以被RNAi所控制。RNAi體系在脊椎動物的免疫系統(tǒng)中起重要作用：它識別入侵的寄生物dsRNA，激發(fā)初始反應(yīng)，然后擴(kuò)大此效應(yīng)以排出異物。因此，RNAi可保護(hù)基因組免受轉(zhuǎn)座子的侵害。第十二頁，共22頁。2、RNAi是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一種機(jī)制

在人類和線蟲的細(xì)胞中RNAi可以用于調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。人體基因組中有數(shù)百個基因編碼被稱為microRNA的小RNA分子。它們含有其他基因的部分密碼。這樣的microRNA可以形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu)并激活RNA機(jī)制阻止蛋白質(zhì)合成，使那一特定基因的表達(dá)沉默。由此，microRNA的遺傳調(diào)節(jié)在生物有機(jī)體的發(fā)育及細(xì)胞功能的控制中起重要作用。第十三頁，共22頁。3、RNAi是基因組功能研究的有力工具

利用RNAi使靶基因沉默在單個基因功能研究中已經(jīng)得巨大成功。其主要原理是：RNAi主要通過在轉(zhuǎn)錄后水平阻斷基因的表達(dá)，使特定基因的mRNA破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)無法合成，出現(xiàn)“基因沉默”。這樣，通過關(guān)閉基因的表達(dá)，當(dāng)某一特定基因被“沉默”后，其功能便反向的體現(xiàn)出來了。第十四頁，共22頁。4、RNAi可能是將來基因治療的新途徑RNAi技術(shù)是一項快速高效的序列特異性基因剔除技術(shù)，在傳染性疾病和惡性腫瘤基因治療領(lǐng)域發(fā)展極為迅速。動物實(shí)驗(yàn)已證明，可以通過RNAi的方法使導(dǎo)致血膽固醇升高的基因“沉默”。針對一些對人類健康嚴(yán)重危害的核酸病毒，如SARS病毒、肝炎病毒、艾滋病病毒等，通過RNAi的方法設(shè)計核酸藥物就比較方便。

eg：哈佛大學(xué)血液研究中心通過RNAi技術(shù)使細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)Fa8受體沉默，成功地在自身免疫性肝炎小鼠模型中預(yù)防了肝衰竭和肝纖維化。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)未接受RNAi治療的小鼠有40％在3d內(nèi)死亡，而40只接受RNAi治療的小鼠有33只活了下來，10d后研究人員檢查這些小鼠的肝臟，發(fā)現(xiàn)完全正常。第十五頁，共22頁。1.siRNA的一般結(jié)構(gòu)：哺乳動物：21-23bpdsRNA

其它生物：更長的片段dTdT（UU）（UU）dTdTsiRNA的設(shè)計第十六頁，共22頁。2.設(shè)計流程（選擇siRNA靶位點(diǎn)）從轉(zhuǎn)錄本AUG起始密碼子開始，搜尋下游AA序列，記錄跟每個AA3’端相鄰的19個核苷酸作為候選的siRNA靶位點(diǎn)；根據(jù)5‘和3’非翻譯區(qū)（UTR)及靠近起始密碼子（75個堿基之內(nèi)）等富含調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域來設(shè)計siRNA。將候選靶位點(diǎn)與相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫比較，去掉哪些與其它編碼序列同源的靶序列。設(shè)計陰性對照：陰性對照siRNA應(yīng)與siRNA的核苷酸組成相同但沒有與基因組明顯同源的序列。一般通過改變siRNA核苷酸順序并經(jīng)同源序列比較確證而得。siRNA的設(shè)計第十七頁，共22頁?；瘜W(xué)合成體外轉(zhuǎn)錄（載體/反應(yīng)體系）轉(zhuǎn)錄載體體內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA的合成第十八頁，共22頁。通過有效的體外轉(zhuǎn)錄合成SiRNA一次反應(yīng)產(chǎn)物足夠幾百次常規(guī)轉(zhuǎn)化每個siRNA只需用戶合成2條脫鹽處理的寡核苷酸DNA（其中8個堿基與T7啟動子引物的5’端互補(bǔ)，onlinetool：/techlib/misc/silencer_siRNA_template.html）包括內(nèi)參模板驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄反應(yīng)效率SilencersiRNAConstructionKit

第十九頁，共22頁。用U6PolIII，在哺乳動物細(xì)胞中合成siRNA，無需另外合成寡核苷酸?？珊推渌麕нx擇性標(biāo)記的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染保證穩(wěn)定表達(dá)siRNAsiRNA合成質(zhì)粒－pSilencer1.0-U6

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