基因工程技術(shù)研究進(jìn)展

Chapter8Advancesintransgenictechnology

1.InducibleexpressionsystemsInmanygene-transferexperiments,theproductionofarecombinantproteinistheultimategoal,inwhichcaseitisgenerallyappropriatetomaximizetransgeneexpressionusingastrongconstitutivepromoter.However,therearealsosituationsinwhichconstitutivepromotersarenotappropriate.Forexample,arecombinantproteinistoxic;thetimingoftransgeneexpressioniscritical;thetissueororganspecificityofintransgeneexpressionisrequired.現(xiàn)在是1頁\一共有57頁\編輯于星期三原核生物基因的結(jié)構(gòu)1）基因區(qū)原核生物的基因多數(shù)以操縱子形式存在，即完成同類功能的多個基因聚集在一起，處于同一個啟動區(qū)的調(diào)控之下，下游同具一個終止子。但各基因分別具有起始密碼子和終止密碼子?；蛑g一般都存在間隔序列。1.1genestructure1.1.1promoter1.1.2codingregion1.1.3terminator現(xiàn)在是2頁\一共有57頁\編輯于星期三2）啟動子(是和RNA聚合酶識別、結(jié)合的一段DNA序列)啟動子(promoter)是一段位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確地結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄。（1）Pribnowbox（－10區(qū)）由六個核苷酸組成的保守序列TATAAT，是RNA聚合酶的結(jié)合位點，此區(qū)的中央大約位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游10bp處。（2）－35區(qū)由六個核苷酸組成的保守序列TTGACA，是RNA聚合酶的識別位點，此區(qū)的中央大約位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游35bp處。

現(xiàn)在是3頁\一共有57頁\編輯于星期三現(xiàn)在是4頁\一共有57頁\編輯于星期三現(xiàn)在是5頁\一共有57頁\編輯于星期三現(xiàn)在是6頁\一共有57頁\編輯于星期三3）SD區(qū)Shine-Dalgarno序列：位于起始密碼子上游約10bp處，富含嘌呤的保守序列(轉(zhuǎn)錄mRNA序列為5’-AGGAGGU-3’)，該區(qū)轉(zhuǎn)錄的序列與30S亞基中16SrRNA富含嘧啶的序列(5’-GAUCACCUCCUUA-3’)互補。4）轉(zhuǎn)錄終止子在一個基因的3’端或是一個操縱子的3’端，提供轉(zhuǎn)錄停止信號的DNA序列稱為終止子(terminator)。所有原核生物的終止子產(chǎn)生的RNA可形成由莖環(huán)構(gòu)成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)可使聚合酶減慢移動或暫停RNA的合成。現(xiàn)在是7頁\一共有57頁\編輯于星期三終止位點上游一般存在一個富含GC堿基（7-20bp）的雙重對稱區(qū)，由這段DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA容易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。AGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAAAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU發(fā)卡結(jié)構(gòu)GCAUCGCGGCCGCGGC

CACAAUUUU

CUCUG現(xiàn)在是8頁\一共有57頁\編輯于星期三真核生物基因的結(jié)構(gòu)1）基因區(qū)真核生物染色體基因組的基因一般單獨存在。在基因內(nèi)部有1至多個非編碼間隔序列區(qū)，稱為內(nèi)含子（intron）。而編碼序列區(qū)稱為外顯子(exon)。盡管某基因是由多個外顯子和內(nèi)含子組成的，但只有一個起始密碼子和一個終止密碼子。現(xiàn)在是9頁\一共有57頁\編輯于星期三2）轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)啟動子的結(jié)構(gòu)特點TATAbox：真核基因的啟動子在－25～－35區(qū)含有TATA序列，確保轉(zhuǎn)錄精確地起始。CAATbox：在－70～－80區(qū)含有CCAAT序列，控制轉(zhuǎn)錄起始頻率。GCbox：在－80～－110區(qū)含有GCCACACCC或GGGCGGG序列，控制轉(zhuǎn)錄起始頻率?，F(xiàn)在是10頁\一共有57頁\編輯于星期三3）轉(zhuǎn)錄終止子一般情況下，RNA聚合酶啟動基因轉(zhuǎn)錄后，它就會沿著模板不停地移動，合成RNA鏈，直到碰上終止信號時才與模板DNA脫離并釋放新生RNA鏈?，F(xiàn)在是11頁\一共有57頁\編輯于星期三基因表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個階段。轉(zhuǎn)錄是以DNA為模板合成RNA的過程，是基因表達(dá)的核心步驟；翻譯是以轉(zhuǎn)錄生成的mRNA為模板合成多肽鏈的過程，是基因表達(dá)的最終目的。DNAReplicationTranscriptionTranslation1.2geneexpression（基因的表達(dá)）現(xiàn)在是12頁\一共有57頁\編輯于星期三1.2.1transcription（轉(zhuǎn)錄）現(xiàn)在是13頁\一共有57頁\編輯于星期三1）轉(zhuǎn)錄的基本過程（1）模板識別RNA聚合酶與啟動子DNA雙鏈相互作用并與之結(jié)合的過程。（2）轉(zhuǎn)錄起始在啟動子區(qū)，RNA聚合酶合成9個核苷酸短鏈。（3）轉(zhuǎn)錄延伸RNA聚合酶離開啟動子區(qū)，沿DNA鏈移動并使新生RNA鏈不斷伸長的過程。（4）轉(zhuǎn)錄終止RNA聚合酶識別特定的終止位點，核苷酸不再加到鏈上，轉(zhuǎn)錄復(fù)合物停止移動，酶和RNA從模板上釋放?，F(xiàn)在是14頁\一共有57頁\編輯于星期三核糖體的活性中心：mRNA結(jié)合部位接受AA-tRNA部位（A位）肽基轉(zhuǎn)移部位（P位）1.2.2translation現(xiàn)在是15頁\一共有57頁\編輯于星期三a.30S小亞基首先與翻譯起始因子IF-1,IF-3結(jié)合。b.30S小亞基通過Shine-Dalgarno序列與mRNA模板結(jié)合，在IF2和GTP的幫助下，fMet-tRNAfMet進(jìn)入小亞基的P位，tRNA的反密碼子與mRNA上的密碼子配對。c.由tRNA,mRNA,3個翻譯起始因子組成的的小亞基復(fù)合物與50S大亞基結(jié)合，GTP水解，釋放翻譯起始因子。現(xiàn)在是16頁\一共有57頁\編輯于星期三Step1:新的aa-tRNA進(jìn)入A位點反密碼子與mRNA密碼子配對不正確的tRNA結(jié)合較弱，在肽鍵形成之前發(fā)生解離。正確的tRNA解離較慢，可以形成肽鍵(需要EF-Tu、GTP及EF-Ts)。Step2:肽鍵形成P位新生肽鏈C端與tRNA分開，與A位aa-tRNA上的氨基酸形成肽鍵Step3:移位2個tRNA由各自的P、A位移動到E、P位（EF-G介導(dǎo)GTP水解提供能量）（2）肽鏈的延伸現(xiàn)在是17頁\一共有57頁\編輯于星期三現(xiàn)在是18頁\一共有57頁\編輯于星期三（3）肽鏈的終止

A位點的終止密碼子不能為任何一種tRNA所識別釋放因子RF可結(jié)合到A位點P位的肽酰基tRNA的脫?；?，釋放新生肽鏈RF3參與的依賴GTP的反應(yīng)導(dǎo)致RF1離開核糖體70S/mRNA/deacylatedtRNA復(fù)合物的解體現(xiàn)在是19頁\一共有57頁\編輯于星期三1.3controlofgeneexpression1.3.1controlofprokaryotictranscription乳糖操縱子的表達(dá)調(diào)控大腸桿菌乳糖操縱子（lactoseoperon）包括四個重要組分：調(diào)節(jié)基因、啟動區(qū)（promoter）、操縱區(qū)（operator）、結(jié)構(gòu)基因(LacZ編碼β—半乳糖苷酶,功能是使乳糖水解為半乳糖和葡萄糖;lacY編碼β—半乳糖苷透過酶,功能是使乳糖進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi);lacA編碼β—半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶,功能是使β—半乳糖乙?；??，F(xiàn)在是20頁\一共有57頁\編輯于星期三現(xiàn)在是21頁\一共有57頁\編輯于星期三4乳糖操縱子在基因工程中的應(yīng)用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylthiogalactoside,IPTG）現(xiàn)在是22頁\一共有57頁\編輯于星期三1.3.2controlofeukaryotictranscription1真核基因表達(dá)調(diào)控的類型1）DNA水平上的基因表達(dá)調(diào)控2）轉(zhuǎn)錄水平上的基因表達(dá)調(diào)控3）轉(zhuǎn)錄后水平上的基因表達(dá)調(diào)控4）翻譯水平上的基因表達(dá)調(diào)控5）蛋白質(zhì)加工水平上的基因表達(dá)調(diào)控現(xiàn)在是23頁\一共有57頁\編輯于星期三2.轉(zhuǎn)錄水平上的基因表達(dá)調(diào)控（基因表達(dá)調(diào)控的重要方式）

真核基因表達(dá)調(diào)控主要也是在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的，通過順式作用元件和反式作用因子復(fù)雜的相互作用來實現(xiàn)的。

1）順式作用元件真核生物啟動子和增強子是由若干DNA序列元件組成的，由于它們常與靶基因連鎖在一起，因此被稱為順式作用元件。（1）啟動子①啟動子的特點啟動子是指確保轉(zhuǎn)錄精確而有效地起始的DNA序列?，F(xiàn)在是24頁\一共有57頁\編輯于星期三①啟動子的結(jié)構(gòu)特點TATAbox：真核基因的啟動子在－25～－35區(qū)含有TATA序列，確保轉(zhuǎn)錄精確地起始。CAATbox：在－70～－80區(qū)含有CCAAT序列，控制轉(zhuǎn)錄起始頻率。GCbox：在－80～－110區(qū)含有GCCACACCC或GGGCGGG序列，控制轉(zhuǎn)錄起始頻率。現(xiàn)在是25頁\一共有57頁\編輯于星期三將TATA區(qū)上游的保守序列稱為上游啟動子元件（upstreampromoterelement,UPE）?，F(xiàn)代分子生物學(xué)把能與某個（類）專一蛋白因子結(jié)合，從而控制基因特異表達(dá)的DNA上游序列稱為應(yīng)答元件（responseelement）?，F(xiàn)在是26頁\一共有57頁\編輯于星期三②啟動子的類型Ⅰ）組成型啟動子Ⅱ）組織或器官特異性啟動子啟動子具有控制組織特異性表達(dá)的元件，其表達(dá)特異性由這些元件的種類、數(shù)目、及相對位置等共同決定。如根特異性啟動子、莖特異性啟動子、葉特異性啟動子、花特異性啟動子、果實或種子特異性啟動子等。Ⅲ）誘導(dǎo)型啟動子啟動子具有應(yīng)答元件，如熱激應(yīng)答元件。誘導(dǎo)型啟動子包括光誘導(dǎo)型啟動子、溫度誘導(dǎo)型啟動子、創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動子、激素應(yīng)答啟動子等。受熱后，果蠅細(xì)胞內(nèi)熱激蛋白70mRNA水平提高1000倍，就是因為熱激因子（蛋白）與熱激蛋白70基因TATA區(qū)上游60bp處的熱激應(yīng)答元件結(jié)合，誘發(fā)轉(zhuǎn)錄起始?，F(xiàn)在是27頁\一共有57頁\編輯于星期三2）反式作用因子起始轉(zhuǎn)錄所需的任何一種蛋白質(zhì)（除去RNA聚合酶），就是轉(zhuǎn)錄因子（TF,transcriptionfactor）。轉(zhuǎn)錄因子是一種重要的反式作用因子,是能夠與真核基因啟動子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性相互作用的蛋白,通過它們之間以及與其他相關(guān)蛋白之間的相互作用,激活或抑制轉(zhuǎn)錄。反式作用因子的四種作用方式：（1）通過與DNA結(jié)合發(fā)揮作用（2）一個轉(zhuǎn)錄因子可以識別另一個轉(zhuǎn)錄因子（3）可識別RNA聚合酶（4）當(dāng)有其它幾種蛋白質(zhì)存在時可以摻入轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物現(xiàn)在是28頁\一共有57頁\編輯于星期三(1)轉(zhuǎn)錄因子的種類基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子(basalfactor)：是RNA聚合酶II在所有啟動子上形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物時所需的轉(zhuǎn)錄因子。活化因子(activator)：是通過作用于啟動子以刺激RNA聚合酶的結(jié)合，從而刺激基因表達(dá)。真核生物中，活化因子結(jié)合的啟動子中的序列，稱為應(yīng)答元件。協(xié)同活化因子(coactivator)：不結(jié)合DNA，是活化因子和基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子相互作用時所需要的轉(zhuǎn)錄因子?，F(xiàn)在是29頁\一共有57頁\編輯于星期三螺旋轉(zhuǎn)角螺旋鋅指結(jié)構(gòu)亮氨基拉鏈螺旋環(huán)螺旋同源異形結(jié)構(gòu)域現(xiàn)在是30頁\一共有57頁\編輯于星期三最初是在爪蟾(Xenopuslaevis)的RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄因子(TFIIIA)中發(fā)現(xiàn)的。9個串聯(lián)重復(fù)的鋅指區(qū)組成，每個單位大約由30個氨基酸殘基組成。基序因在鋅結(jié)合位點上突出的氨基酸環(huán)的形狀如同手指，所以稱為“指狀”結(jié)構(gòu)。這種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域是同DNA或RNA結(jié)合的部位。單個的鋅指保守序列是：Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X2-His

這里x2、x5代表2個和5個任何一種氨基酸殘基。現(xiàn)在是31頁\一共有57頁\編輯于星期三亮氨酸是疏水性氨基酸，排列在雙螺旋的一側(cè)，所有帶電荷的氨基酸殘基排在另一側(cè)。當(dāng)2個蛋白質(zhì)分子平行排列時，亮氨酸之間相互作用形成二聚體，形成“拉鏈”。由于這類蛋白質(zhì)都以二聚體形式與DNA結(jié)合，兩個蛋白質(zhì)α螺旋上的亮氨酸一側(cè)是形成拉鏈型二聚體的基礎(chǔ)。然而，亮氨酸拉鏈區(qū)并不能直接結(jié)合DNA，只有肽鏈氨基端20～30個富含堿性氨基酸結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合?，F(xiàn)在是32頁\一共有57頁\編輯于星期三（2）轉(zhuǎn)錄因子的作用作用于啟動子之應(yīng)答元件以刺激RNA聚合酶的結(jié)合，從而刺激基因表達(dá).現(xiàn)在是33頁\一共有57頁\編輯于星期三能與某個（類）專一蛋白因子結(jié)合，從而控制基因特異表達(dá)的DNA上游序列稱為應(yīng)答元件（responseelement），如熱激應(yīng)答元件（HSE,heatshockresponseelement），糖皮質(zhì)應(yīng)答元件（glucocorticoidresponseelement,GRE），金屬應(yīng)答元件（metalresponseelement,MRE）。它們與細(xì)胞內(nèi)高度專一的轉(zhuǎn)錄因子(活化因子)相互作用，協(xié)調(diào)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)在是34頁\一共有57頁\編輯于星期三現(xiàn)在是35頁\一共有57頁\編輯于星期三舉例1：類固醇激素（性激素、糖皮質(zhì)激素等）誘導(dǎo)的基因表達(dá)靶細(xì)胞內(nèi)具有專一的細(xì)胞質(zhì)受體（活化因子），可與激素形成復(fù)合物，導(dǎo)致三維結(jié)構(gòu)甚至化學(xué)性質(zhì)的變化。經(jīng)修飾的受體與激素復(fù)合物通過核膜進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并與染色質(zhì)特定區(qū)域（應(yīng)答元件）結(jié)合，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄的起始。現(xiàn)在是36頁\一共有57頁\編輯于星期三許多生物受熱誘導(dǎo)時能合成一系列熱激蛋白（heatshockprotein）。例如，受熱后果蠅細(xì)胞內(nèi)熱激蛋白mRNA水平提高1000倍。此現(xiàn)象是由熱激因子（heatshockfactor,HSF）與熱激蛋白基因TATA區(qū)上游60bp處的熱激應(yīng)答元件（heatshockresponseelement,HSE）結(jié)合，誘發(fā)轉(zhuǎn)錄形成的。舉例2：熱激蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

現(xiàn)在是37頁\一共有57頁\編輯于星期三Heatstresseffectsonproteinsynthesisinsoybeanseedlings(J.Key).現(xiàn)在是38頁\一共有57頁\編輯于星期三Heat-shocktranscriptionfactor(HSF)BindstoHSEsContainsleucinezippermotifsActivityisinducedbyheat,andphosphorylationActivityRepressedbyHSP70現(xiàn)在是39頁\一共有57頁\編輯于星期三在沒有受熱或其它環(huán)境脅迫時，HSF主要以單體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)和核內(nèi)。單體HSF沒有DNA結(jié)合能力，Hsp70可能參與了維持HSF的單體形式。受到熱激時，細(xì)胞內(nèi)變性蛋白增多，它們與HSF競爭結(jié)合Hsp70，從而釋放HSF，使之形成三體并輸入核內(nèi)。HSF一旦形成三體，便具有與HSE特異結(jié)合、促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的功能。現(xiàn)在是40頁\一共有57頁\編輯于星期三現(xiàn)在是41頁\一共有57頁\編輯于星期三舉例3:cAMP信號系統(tǒng)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄CRE(cAMPresponseelement)

CREB(cAMPresponseelementbindingprotein)現(xiàn)在是42頁\一共有57頁\編輯于星期三誘導(dǎo)表達(dá)克隆載體誘導(dǎo)表達(dá)克隆載體中的啟動子在特殊的誘導(dǎo)條件下才具有轉(zhuǎn)錄活性。例如熱誘導(dǎo)表達(dá)克隆載體，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)表達(dá)克隆載體現(xiàn)在是43頁\一共有57頁\編輯于星期三基因在染色體定位整合的原理：同源重組2.Applicationofsite-specifichomologousrecombination(基因定位整合)現(xiàn)在是44頁\一共有57頁\編輯于星期三染色體定位整合克隆載體1基因整合平臺系統(tǒng)1）整合平臺指受體細(xì)胞染色體DNA上的一個特定區(qū)域，是外源DNA的定位整合位點。2）定位整合載體定位整合載體除了一般質(zhì)?？寺≥d體必須具備的元件外，還必須含有一個或兩個與整合平臺DNA序列同源的DNA片段（大于1kb）。現(xiàn)在是45頁\一共有57頁\編輯于星期三3.Furthertransgenicstrategiesforgeneinhibition3.1antisenseRNA

AntisenseRNAhastheoppositesensetomRNA.ThepresenceofcomplementarysenseandantisenseRNAmoleculesinthesamecellcanleadtotheformationofastableduplex,whichmayinterferewithgeneexpressionattheleveloftranscription,RNAprocessingorpossiblytranslation.現(xiàn)在是46頁\一共有57頁\編輯于星期三5′

CAUG

3′

mRNA

3′

GUAC

5′

AntisenseRNA反義RNA作用原理現(xiàn)在是47頁\一共有57頁\編輯于星期三In1988,Smithetal.generatedtransgenictomatoplantscarryinganantisenseconstructtargetingtheendogenouspolygalacturonase(PG)gene.Theproductofthisgeneisanenzymethatcausessofteningandleadstooverripening.ThelevelsofpgmRNAintransgenicplantswerereducedto6%ofthenormallevelsandthefruithadalongershelf-lifeandshowedresistancetobruising.現(xiàn)在是48頁\一共有57頁\編輯于星期三3.2RNAinterference(RNAi)

RNAiisanovelphenomenonthathasthepotentialtobecomeanextremelypowerfultoolforgenesilencinginanyorganism.OnlyafewmoleculesofdsRNAwerenecessaryforRNAi.InterferencecouldbeachievedonlyifthedsRNAwashomologoustotheexonsofatargetgene.DsRNAcreatssmallRNAmolecules,calledguideRNAs.GuideRNAsmayassemblewithcertainproteinstogenerateacatalyticendonucleasecomplexthatcleavestargetmRNAmoleculesefficientlyandinahomology-dependentfashion.現(xiàn)在是49頁\一共有57頁\編輯于星期三