高中生物選修專題一基因工程課件

基因工程專題復(fù)習(xí)近五年，基因工程只要考點：1、基因工程的工具；限制酶，DNA連接酶，運載體單獨考察比較少。2、基因工程的操作步驟中，目的基因的獲取年年考。重點考察“從基因文庫與CDNA文庫的構(gòu)建過程及區(qū)別”另外，“基因表達載體的構(gòu)建”也是考察的重點。經(jīng)常與限制酶、DNA連接酶一起考察，涉及啟動子、終止子、標記基因等。3、導(dǎo)入受體細胞的考察較簡單，2010與2013年主要集中在導(dǎo)入動物和植物細胞中。4、目的基因的檢測與鑒定是重點考察內(nèi)容，每年都有涉及，分子水平和個體水平都考察，重點理解分子雜交；蛋白質(zhì)工程考察較少。什么叫基因工程？

基因工程又叫基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。該技術(shù)是在生物體外，通過對DNA分子進行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細胞內(nèi)進行無性繁殖，使重組基因在受體細胞內(nèi)表達，產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物。（一）基因工程的概念基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平人類需要的基因產(chǎn)物剪切→

拼接→

導(dǎo)入→表達識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。主要是從原核生物中分離純化出來的一種酶。能將外來的DNA切斷，由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進行的，故名限制性內(nèi)切酶。4000種。1、來源：2、種類：3、作用：4、結(jié)果：形成兩種末端一、“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶粘性末端平末端什么叫黏性末端？被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。什么叫平末端？當限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。拓展（EcoRⅠ)能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開形成黏性末端，在切開后的序列正著讀和反著讀堿基序列都一樣稱之為回文序列回文對：

乾隆客上天然居，居然天上客；紀曉嵐人過大佛寺，寺佛大過人。二、“分子縫合針”——DNA連接酶

1、DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，是把梯子兩邊扶手的斷口連接起來，這樣一個重組的DNA分子才能形成。②DNA連接酶——分子縫合針：E.coliDNA連接酶：只能連黏性末端。T4DNA連接酶：還能連平末端，但效率較低。來源：前者源于大腸桿菌；后者源于T4噬菌體。大腸桿菌T4噬菌體1.作用：

要讓一個從甲生物細胞內(nèi)取出來的基因在乙生物體內(nèi)進行表達，首先得將這個基因送到乙生物的細胞內(nèi)去。能將外源基因送入細胞的工具就是運載體。將外源基因送入受體細胞。

3、分子運輸車—運載體2、載體的種類1、質(zhì)粒：是一種裸露、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于細菌擬核DNA之外，具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子；2、λ噬菌體的衍生物；3、動植物病毒等。

作為運載體必須具備的條件1.能夠在宿主細胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。2.具有一個或多個限制酶切割點，便于供外源DNA片段插入。3.具有特殊的標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。

3.質(zhì)粒特點：一、目的基因的獲取1.基因的結(jié)構(gòu)2.目的基因的概念3.目的基因的獲取的方法1.基因的結(jié)構(gòu)（1）原核生物基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游編碼蛋白質(zhì)調(diào)控遺傳信息的表達（調(diào)控程序）…A‥………ATGTGCACGTAGTTA………‥G……T‥………TACACGTGCATCAAT………‥C…啟動子終止子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)（能編碼蛋白質(zhì)）啟動子終止子真核與原核生物基因結(jié)構(gòu)的比較外顯子內(nèi)含子編碼蛋白質(zhì)（不能編碼蛋白質(zhì)）①相同點：都是由能夠編碼蛋白質(zhì)的編碼區(qū)和具有調(diào)控作用的非編碼區(qū)。②不同點：原核細胞基因的編碼區(qū)是連續(xù)的；真核細胞的編碼區(qū)是間隔的，不連續(xù)的。（2）真核生物基因結(jié)構(gòu)3.目的基因的獲取的方法（3）用化學(xué)方法直接人工合成目的基因（1）從基因庫中獲取目的基因（2）應(yīng)用PCR技術(shù)擴增目的基因（1）從基因庫中獲取目的基因①基因文庫和部分基因文庫的慨念②基因組文庫和cDNA文庫的主要區(qū)別③怎樣從基因文庫中找到我們所需要的目的基因①基因文庫和部分基因文庫的慨念：

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫。

基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫?；蛭膸熘邪艘环N生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫。如：cDNA文庫。部分基因文庫的建立方法mRNA反轉(zhuǎn)錄酶單鏈DNA合成雙鏈DNA（cDNA）

載體插入導(dǎo)入受體菌群（cDNA文庫）分離目的基因cDNA合成過程

第一步：反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步：核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步：以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。26（2）應(yīng)用PCR技術(shù)擴增目的基因①定義：②原理：DNA復(fù)制

PCR是多聚酶鏈式反應(yīng)，是一項在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)，在短時間內(nèi)大量擴增目的基因DNA分子熱變性（在90～95OC時，解旋，雙鏈分開溫度降低又結(jié)合成雙鏈）因此，在PCR技術(shù)中不需要解旋酶（與復(fù)制不同之在處)③儀器：PCR擴增儀（自動調(diào)控溫度的儀器）④條件：有一段已知的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物，脫氧核苷酸，酶等。④過程：a.DNA熱變性（90～95OC)：b.復(fù)性或退火（55～60OC)：c.延伸（70～75OC)：d.重復(fù)a.b.c步驟：

雙鏈DNA模板在熱的作用下，氫鍵斷裂形成單鍵DNA系統(tǒng)溫度降低，引物結(jié)合到互補DNA鏈上，形成局部的雙鏈DNA

在Taq酶作用下，合成與模板互補的DNA子鏈，形成雙鏈DNA每重復(fù)一次，目的基因增加一倍PCR擴增為指數(shù)形式擴增2n(n為擴增循環(huán)的次數(shù)），在短時間內(nèi)擴增大量目的基因。(3)用化學(xué)方法直接人工合成目的基因蛋白質(zhì)氨基酸序列→mRNA的核苷酸序列→目的基因序列→

目的基因針對：基因比較小，核苷酸序列又已知推測化學(xué)合成推測1.目的：二.基因表達載體的構(gòu)建——核心IMN2.組成：①使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代。②同時使目的基因能表達和發(fā)揮作用。(3)終止子(4)標記基因(2)啟動子(1)目的基因

不同受體細胞，目的基因?qū)胧荏w細胞的方法不同，基因表達載體的構(gòu)建有所差異。質(zhì)粒DNA分子限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種基因表達載體的構(gòu)建33三、將目的基因?qū)胧荏w細胞1.轉(zhuǎn)化：目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的工程2.常見轉(zhuǎn)化方法：①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：雙子葉植物和裸子植物。（1）將目的基因?qū)胫参锛毎刍驑尫ǎ簡巫尤~植物。②花粉管通道法（3）將目的基因?qū)胛⑸锛毎惺軕B(tài)細胞法。（2）將目的基因?qū)雱游锛毎@微注射法。①特點:

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：（1）將目的基因?qū)胫参锛毎芨腥倦p子葉植物和祼子植物,對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力②過程：Ti質(zhì)粒的T—DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞并整合到其染色體上③適用生物：雙子葉植物、祼子植物。基因槍法：利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法①操作方法：②金屬粒：將目的基因?qū)雴巫尤~植物細胞鎢粉粒子和金粉粒子，粒子的直徑一般在0.6～4um。③適用：單子葉植物舊式的基因槍靠火藥為動力，將子彈頭上粘的ＤＮＡ打出。其原理和聲音都與鳥槍相仿，成功率僅為千分之八。小圖為子彈新式的基因槍靠高壓氦氣為動力，將微粒載片上的ＤＮＡ送出，成功率在１５％左右。小圖為微粒載片和阻擋網(wǎng)。手提式基因搶花粉管通道法：將目的基因?qū)胫参锛毎俨僮鞣椒ǎ孩谔攸c：在植物花受粉后，花粉形成花粉管還末愈合前期，剪去柱頭，然后，滴入DNA（含目的基因）使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞十分簡便經(jīng)濟③例：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉①細胞類型：②操作程序：___顯微注射法：（2）將目的基因?qū)雱游锛毎l(fā)育成新性狀動物移植到子宮或輸卵管培養(yǎng)成早期胚胎顯微注射取受精卵（體內(nèi)或體外受精）提純含目的基因表達載體受精卵倒置顯微注射儀德國萊卡公司將目的基因?qū)雱游锛毎孩鄢Ｓ梅ǎ孩诔Ｓ镁孩傥⑸镒魇荏w細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少④過程：大腸桿菌Ca2+處理獲得感受態(tài)細胞Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA___感受態(tài)細胞法（3）將目的基因?qū)胛⑸锛毎?/p>

目的基因的檢測與鑒定（1）DNA分子與DNA分子的之間雜交（2）DNA分子與RNA分子的之間雜交（3）蛋白質(zhì)分子（抗原與抗體）之間雜交2.個體生物學(xué)水平的鑒定：抗蟲、抗病結(jié)種實驗，活性比較實驗1.檢測方法：分子雜交技術(shù)：1.檢測轉(zhuǎn)基因生物的DNA探針15N15N14N14N（1）檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因基因探針：放射性同位素等標記的DNA分子方法：DNA分子雜交技術(shù)變性變性變性方法：DNA分子雜交技術(shù)（2）檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA探針15N15N轉(zhuǎn)基因生物的mRNA14N14N如果顯示出雜交帶，就表明待測樣品目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)錄。提?。?）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法：抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從