基因文庫技術(shù)課件

第六章基因文庫技術(shù)

(Thetechnologyofgenelibraries)

一、基因文庫(Genelibraries)

匯集著基因組所有的DNA序列的重組體DNA群體為

基因文庫(Genelibraries)或基因庫(genelibraries)，

DNA文庫(DNAlibraries)。

由基因組DNA所制成的基因文庫稱為基因組文庫

(genomiclibraries)，由互補DNA所制成的稱為

cDNA文庫(cDNAlibraries)。

(bank，libraries，pool，reservoir)二、基因組文庫

（genomiclibrary）1、基因組文庫的概念將某種生物的全部遺傳組成（DNA）切成適當(dāng)長度的片段，連接在載體上，轉(zhuǎn)化到宿主細胞中而構(gòu)建的基因文庫，就稱為基因組文庫。為了要分離到一個確實含有目的基因的克隆，究竟要篩選多少個重組體克隆呢？3、基因組文庫的大小

1976年，L.Clark和J.Carbon提出了一個經(jīng)驗公式：

N=ln(1-p)/ln(1-x/y)N:完全基因文庫所應(yīng)包含的重組DNA的轉(zhuǎn)化子克隆數(shù)（基因文庫大?。㏄：在重組體群體中出現(xiàn)目的基因序列的概率（一般為99%）X：文庫中每個克隆所含的外源DNA片段的平均長度Y：該生物基因組的大小（單倍體基因組長度）舉例：

為了獲得豬垂體生長激素PGH基因，用豬垂體細胞分離制取構(gòu)建PGH基因文庫時，用上式計算，

X：插入的DNA片段平均長度16kb,Y：單倍體長度3.30×106kb，

N=9.67×105個，如果實驗中得到106個重組噬菌體，符合基因組文庫大小的要求，即99%可能篩選出所需的PGH基因。三、cDNA文庫1、概念：通過一系列的酶催作用，使總Poly(A)mRNA轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA群體，并插入到適當(dāng)?shù)妮d體分子上，然后再轉(zhuǎn)化給大腸桿菌寄主菌株的細胞內(nèi)。如此便構(gòu)成了包含著所有基因編碼序列的cDNA基因文庫。分離細胞總RNA,然后從中純化出主要含mRNA的部分合成第一鏈cDNAoligo(dT)引導(dǎo)的cDNA合成法、隨機引物引導(dǎo)的cDNA合成法將mRNA-DNA雜交分子轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA分子自我引導(dǎo)合成法、RNaseH酶降解取代法將cDNA甲基化及加連接子將合成的雙鏈cDNA重組到質(zhì)粒載體或噬菌體載體上導(dǎo)入寄主細胞增殖

總RNA的完整性的鑒定libraries以λ噬菌體構(gòu)建cDNA文庫4、cDNA文庫的優(yōu)點1、cDNA克隆以mRNA為起始材料，這對于有些RNA病毒來說非常適用。因為它們的增殖并不經(jīng)過DNA中間體。2、cDNA基因文庫的篩選簡單易行。3、每一個cDNA克隆都含有一種mRNA序列，在選擇中出現(xiàn)假陽性幾率比較低。4、克隆在細菌中表達的基因和基因序列結(jié)構(gòu)的測定。5、表達序列標(biāo)簽的研究（expressedsequencetags,EST)5、cDNA文庫的應(yīng)用用于篩選基因。通過c