食品微生物課件

食品微生物課件第1頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月本次課程內(nèi)容1.自然界中分離的方法步驟2.微生物的誘變育種3.微生物的雜交育種4.原生質(zhì)體融合育種（略）5.基因工程育種第2頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、自然界中分離的方法步驟（P148）1.采樣2.增殖培養(yǎng)3.純種分離4.純培養(yǎng)5.生產(chǎn)性能測(cè)定第3頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月從生產(chǎn)中選育：在生產(chǎn)過(guò)程中，微生物以一定頻率發(fā)生自發(fā)突變。為選育優(yōu)良的生產(chǎn)菌種創(chuàng)造了機(jī)會(huì)。定向培育優(yōu)良品種：一般指用某一特定因素長(zhǎng)期處理某微生物的群體（culturepopulation），同時(shí)不斷地對(duì)它們進(jìn)行移種傳代，以達(dá)到積累并選擇相應(yīng)的自發(fā)突變株的目的。采用梯度平板法（gradientplate）：篩選抗代謝拮抗物的突變株，以提高相應(yīng)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量方面的工作，可認(rèn)為是微生物定向培育技術(shù)的一大進(jìn)展。例如，異煙肼是吡哆醇的代謝拮抗物（即結(jié)構(gòu)類似物），篩選抗異煙肼的菌株，可得到吡哆醇的高產(chǎn)菌。菌種分離的方法第4頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月例：定向培育抗異煙肼的吡哆醇高產(chǎn)突變株的方法

先在培養(yǎng)皿中加入10ml的一般瓊脂培養(yǎng)基，使皿底斜放，待凝固后，將皿底放平，再在原先的培養(yǎng)基上倒10ml含有適當(dāng)濃度（通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)決定）的異煙肼培養(yǎng)基，斜放、待凝。在制成的瓊脂平板上存在一個(gè)由濃到稀的異煙肼的濃度梯度。然后涂以大量的酵母細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后，在低濃度的異煙肼區(qū)域，長(zhǎng)滿了原始的敏感菌，在高濃度區(qū)域，酵母細(xì)胞生長(zhǎng)受到了抑制，在濃度適中的部位出現(xiàn)少數(shù)由抗異煙肼的細(xì)胞所形成的菌落。這類抗性菌落可能因產(chǎn)生了可分解異煙肼的酶類，更多的是通過(guò)合成更高濃度的代謝產(chǎn)物——吡哆醇來(lái)克服異煙肼的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。在酵母菌中，通過(guò)梯度平板法曾獲得吡哆醇產(chǎn)量比原菌株提高7倍的突變株。應(yīng)用同樣原理，還可獲得其它種種有關(guān)代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)菌株。第5頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、誘變育種誘變育種：利用物理或化學(xué)誘變劑處理均勻而分散的微生物細(xì)胞群，促進(jìn)其突變率顯著提高，然后采用簡(jiǎn)便、快速和高效的篩選方法，從中挑選少數(shù)符合育種目的的突變株，以供生產(chǎn)實(shí)踐或科學(xué)研究之用。

誘變育種具有極其重要的實(shí)踐意義：當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門所使用的高產(chǎn)菌株，幾乎毫無(wú)例外地都是通過(guò)誘變育種而明顯提高其生產(chǎn)性能的。第6頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月誘變育種的基本環(huán)節(jié)以選育高產(chǎn)突變株為例，誘變育種的基本環(huán)節(jié)概括如下：

絕大多數(shù)

個(gè)體死亡出發(fā)菌株誘變 多數(shù)未變

少數(shù)存活

少數(shù)突變 多數(shù)幅度小

少數(shù)正變 多數(shù)不宜投產(chǎn)

少數(shù)幅度大

少數(shù)適宜投產(chǎn)

可計(jì)算：存活率 突變率正變率“高產(chǎn)率” “投產(chǎn)率”

第7頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株（originalstrain）選用出發(fā)菌株的一般原則：①最好是經(jīng)過(guò)生產(chǎn)中選育過(guò)的自發(fā)變異菌株；②采用具有優(yōu)良性狀的菌株，如生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)要求低以及產(chǎn)孢子早而多的菌株③選擇已發(fā)生其他變異的菌株作為出發(fā)菌株；④細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)稱為增變菌株的變異菌株，更適宜作出發(fā)菌株；⑤在選擇產(chǎn)核苷酸或氨基酸的出發(fā)菌株時(shí)，最好考慮至少能累積少量所需產(chǎn)物或其前體的菌株，而在選擇產(chǎn)抗生素的出發(fā)菌株時(shí)，最好選擇已通過(guò)幾次誘變并發(fā)現(xiàn)每次的效價(jià)都有一定程度提高的菌株作為出發(fā)菌株。第8頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月處理單孢子（或單細(xì)胞）懸液對(duì)單細(xì)胞微生物必須處理單細(xì)胞、均勻懸液的原因分散狀態(tài)的細(xì)胞可以均勻接觸誘變劑，避免長(zhǎng)出不純菌落。處理霉菌或放線菌孢子的原因：絲狀微生物的細(xì)胞內(nèi)同時(shí)含有幾個(gè)核，故某一突變無(wú)法反映在當(dāng)代的表型上。只有當(dāng)經(jīng)過(guò)DNA的復(fù)制發(fā)生細(xì)胞分裂后，這一變異才會(huì)在表型上表達(dá)出來(lái)，于是出現(xiàn)了不純菌落，這就叫表型延遲（phenotypiclag）（或由于誘變劑一般只作用于DNA雙鏈中的某一條單鏈，也會(huì)出現(xiàn)表型延遲）。這也是誘變育種工作中初分離的菌株經(jīng)傳代后很快出現(xiàn)生產(chǎn)性狀“衰退”的主要原因。獲得均勻分散的細(xì)胞懸液的方法：用無(wú)菌的玻璃珠打碎成團(tuán)的細(xì)胞，然后再用脫脂棉過(guò)濾。誘變后出現(xiàn)的不純菌落，則可用適當(dāng)?shù)姆蛛x純化方法加以純化。第9頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月誘變育種工作中應(yīng)考慮的幾個(gè)原則

選擇簡(jiǎn)便有效的誘變劑：物理誘變劑：紫外線、激光；X射線、γ射線和快中子等。化學(xué)誘變劑：主要有烷化劑、堿基類似物和丫啶類化合物。擬輻射物質(zhì)：有些烷化劑例如氮芥、硫芥和環(huán)氧乙烷等除了能誘發(fā)各種點(diǎn)突變外，還能誘發(fā)一般只有輻射才能誘發(fā)的染色體畸變，所以它們也被稱為擬輻射物質(zhì)。第10頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月選擇誘變劑的種類：在選用理化因子作誘變劑時(shí)，在同樣效果下，應(yīng)選用最方便的因素；而在同樣方便的情況下，則應(yīng)選擇最高效的因素。在物理誘變劑中，尤以紫外線為最方便，而在化學(xué)誘變劑中，一般可選用誘變效果最為顯著的“超誘變劑”，如NTG(N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍)。采用簡(jiǎn)便有效的誘變方法：紫外線的照射最為方便。化學(xué)誘變劑的種類、濃度和處理方法尤其是中止反應(yīng)的方法很多，實(shí)際工作時(shí)可參看有關(guān)書籍。一種較有效的簡(jiǎn)易處理方法的大致操作步驟是：先在平板上涂上出發(fā)菌株細(xì)胞，然后在平板上均勻地放上幾顆很小的誘變劑顆粒（也可放吸有誘變劑溶液的濾紙片），經(jīng)培養(yǎng)后，在制菌圈的邊緣挑取若干突變菌落，分別制成懸浮液，然后將其涂在一般平板表面使長(zhǎng)出許多單菌落，最后可用影印培養(yǎng)法或逐個(gè)檢出法選出突變種。第11頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)（synergism）

誘變劑的復(fù)合處理常常呈現(xiàn)一定的協(xié)同效應(yīng)，這對(duì)育種工作是很有參考價(jià)值的。復(fù)合處理有幾類：①兩種或多種誘變劑的先后使用；②同一種誘變劑的重復(fù)使用；③兩種或多種誘變劑的同時(shí)使用。第12頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)為了確切某一突變株產(chǎn)量性狀的提高程度，必須進(jìn)行大量的分析測(cè)定和統(tǒng)計(jì)工作，而一些形態(tài)變異雖能直接和迅速地加以觀察，但又不一定與產(chǎn)量變異相關(guān)。如果能找到這兩者間的相關(guān)性，則育種時(shí)初篩的效率就可大大提高。如在灰黃霉素產(chǎn)生菌蕁麻青霉的育種中，發(fā)現(xiàn)菌落的棕紅顏色變深者，產(chǎn)量往往有所提高形態(tài)、生理與代謝產(chǎn)物產(chǎn)量間的相關(guān)性常?？赏ㄟ^(guò)人們的努力而加以創(chuàng)造。利用鑒別性培養(yǎng)基的原理或其它方法就可有效地把原來(lái)肉眼所觀察不到的生理性狀或產(chǎn)量性狀轉(zhuǎn)化為可見的“形態(tài)”性狀。例如，在瓊脂平板上，通過(guò)蛋白酶水解圈的大小、淀粉酶變色圈的大小，抗生素抑制圈的大小，生長(zhǎng)因子周圍某菌生長(zhǎng)圈的大小，以及外毒素的沉淀反應(yīng)圈的大小等，都可用于初篩工作中估計(jì)某菌產(chǎn)生相應(yīng)代謝產(chǎn)物能力的“形態(tài)”指標(biāo)。第13頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月選用最適劑量誘變劑劑量：一般指強(qiáng)度與作用時(shí)間的乘積。各種誘變劑有不同的劑量表示方式，如化學(xué)誘變劑以一定溫度下誘變劑的濃度和處理時(shí)間來(lái)表示。在育種實(shí)踐中，常以殺菌率來(lái)作誘變劑的相對(duì)劑量。誘變劑的合適劑量：凡在提高誘變率的基礎(chǔ)上，能擴(kuò)大變異幅度，促使變異移向正變范圍的劑量，就是合適的劑量。要確定一個(gè)合適的劑量，常常要經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)。就一般微生物而言，在一定的劑量范圍內(nèi)，突變率往往隨劑量的增高而提高，但正變較多出現(xiàn)在偏低的劑量中，而負(fù)變則較多出現(xiàn)在偏高的劑量中；還發(fā)現(xiàn)經(jīng)多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株中，更容易出現(xiàn)負(fù)變。因此，在誘變育種工作中，目前大家比較傾向于采用較低的劑量。第14頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月篩選方案在實(shí)際工作中，一般認(rèn)為應(yīng)采用把篩選工程分為初篩與復(fù)篩兩個(gè)階段的篩選方案為好。前者以量（選留菌株的數(shù)量）為主，后者以質(zhì)（測(cè)定數(shù)據(jù)的精確度）為主。例如，在工作量限度為200只搖瓶的具體條件下，為了取得更大的工效，有人提出了一些優(yōu)選的篩選方案（可參考有關(guān)專著）第15頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月篩選方法一般通過(guò)初篩與復(fù)篩對(duì)突變株進(jìn)行生產(chǎn)性能的測(cè)定。初篩既可在培養(yǎng)皿平板上進(jìn)行，也可在搖瓶中進(jìn)行，兩者各有利弊。復(fù)篩是對(duì)突變株的生產(chǎn)性能作比較精確的定量測(cè)定。一般是將微生物搖瓶培養(yǎng)，然后再對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行分析測(cè)定。不僅需要設(shè)計(jì)效率更高的篩選方法，還應(yīng)努力推廣篩選操作的自動(dòng)化。

第16頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月例：營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選第17頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月與篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株有關(guān)的三類培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基（MM，minimalmedium）：僅能滿足某微生物的野生型菌株生長(zhǎng)需要的最低成分組合培養(yǎng)基，稱基本培養(yǎng)基?？捎梅?hào)“[－]”來(lái)表示。完全培養(yǎng)基（CM，completemedium）：凡可滿足一切營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株?duì)I養(yǎng)需要的組合培養(yǎng)基，可稱為完全培養(yǎng)基?？捎梅?hào)“[＋]”。補(bǔ)充培養(yǎng)基（SM，supplementalmedium）：凡只能滿足相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)需要的組合培養(yǎng)基，稱為補(bǔ)充培養(yǎng)基。補(bǔ)充培養(yǎng)基的符號(hào)可根據(jù)加入的是A或B等代謝物而分別用[A]或[B]等來(lái)表示。第18頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月與營(yíng)養(yǎng)缺陷突變有關(guān)的三類遺傳型個(gè)體野生型：從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生營(yíng)養(yǎng)缺陷突變前的原始菌株。營(yíng)養(yǎng)缺陷型：野生型菌株經(jīng)誘變處理后，喪失了某酶的合成能力，只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，這類突變稱為營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株（簡(jiǎn)稱營(yíng)養(yǎng)缺陷型）。原養(yǎng)型：營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變經(jīng)回變或重組后產(chǎn)生的菌株，營(yíng)養(yǎng)要求在表型上與野生型相同。第19頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選方法誘變劑處理淘汰野生型（抗生素法、菌絲過(guò)濾法）檢出缺陷型（夾層培養(yǎng)法、限量補(bǔ)充培養(yǎng)法、逐個(gè)檢出法、影印接種法）鑒定缺陷型（生長(zhǎng)譜法）第20頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、微生物的雜交育種1、酵母菌的雜交育種1）酵母子囊孢子的形成2）子囊孢子的分離3）雜交種的獲得2、霉菌的雜交育種1）選擇親本2）強(qiáng)制形成異核體3）轉(zhuǎn)移單菌落4）檢驗(yàn)其穩(wěn)定性5）誘變處理第21頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月四、原生質(zhì)體融合育種（略）第22頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月五、基因工程育種基因工程：1、提取目的基因2、處理目的基因3、體外重組4、載體傳遞5、復(fù)制、表達(dá)6、篩選、繁殖第23頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的存在部位和方式（一）核酸存在的七個(gè)水平及質(zhì)粒細(xì)胞水平： 存在于細(xì)胞核或核質(zhì)體細(xì)胞核水平： 單核或多核結(jié)構(gòu)染色體水平： 倍性(真核)和染色體數(shù)核酸水平：在原核中同染色體水平、存在部分二倍體、DNA或RNA，復(fù)合或裸露，雙鏈或單鏈基因水平：一切具有自主復(fù)制能力的遺傳功能單位均可稱為基因。1000bp大小，分子量約6.7×105Dalton密碼子水平：第三位模糊,起始和終止,信息單位核苷酸水平：突變或交換單位第24頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基因工程基因工程：用人為的方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)----DNA大分子提取出來(lái)，在離體的條件下用適當(dāng)?shù)墓ぞ呙高M(jìn)行切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來(lái)，然后與載體一起導(dǎo)入某一更易生長(zhǎng)、繁殖的受體細(xì)胞中使供體DNA進(jìn)行正常的復(fù)制和表達(dá)，從而獲得新物種的一種嶄新的育種技術(shù)?；蚬こ淘谑称饭I(yè)中的應(yīng)用：

工程菌的構(gòu)建（外源基因的表達(dá)、工業(yè)發(fā)酵用菌種的改造）工業(yè)用酶蛋白的該性（第二代基因工程）第25頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基因工程的基本操作基因工程操作一般分為以下四個(gè)步驟：目的基因的取得載體的選擇目的基因與載體DNA的體外重組重組載體引入受體細(xì)胞第26頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月獲得目的基因的主要方法從供體細(xì)胞的DNA中分離（酶切法、PCR擴(kuò)增）通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶的作用由mRNA合成cDNA（拷貝數(shù)少的目的基因的獲得）由化學(xué)方法合成特定功能的基因（磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亞磷酸三酯法，合成的長(zhǎng)度150—200bp，作用：合成基因的元件、合成引物、合成探針、用于基因的定點(diǎn)誘變、作為重組DNA連接的構(gòu)件）

第27頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月載體的選擇載體必須具備的幾個(gè)條件：必須是一個(gè)復(fù)制子在受體細(xì)胞中有較高的復(fù)制率最好只有一個(gè)內(nèi)切酶切口必須具有選擇性遺傳標(biāo)記目前常用載體：

質(zhì)粒載體

噬菌體（λ－噬菌體）載體

柯斯質(zhì)粒載體（噬菌體DNA的COS序列和質(zhì)粒復(fù)制子構(gòu)成的特殊類型的質(zhì)粒載體）第28頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月目的基因與載體DNA的體外連接核酸內(nèi)切酶與DNA分子的體外切割：

在基因工程中，必須使用特定的內(nèi)切酶（一般為Ⅱ型內(nèi)切酶）消化目的基因與載體DNA，使它們產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端或平末端，如EcoRⅠ消化DNA產(chǎn)生的粘性末端為：

G3’5’AATTCCTTAA5’3’G

目的基因與載體DNA用同一種內(nèi)切酶消化，即產(chǎn)生相同的粘性末端，在低溫（5--6℃）下進(jìn)行退火時(shí)，互補(bǔ)的粘性末端配對(duì)重新形成帶缺口的雙鏈。

DNA連接酶進(jìn)行目的基因與載體DNA的體外連接粘性末端連接（來(lái)源于E.coli的DNA連接酶）；平末端連接（T4DNA連接酶）第29頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月重組載體引入受體細(xì)胞受體細(xì)胞的種類：微生物細(xì)胞（E.coliB.subtilisS.cerevisiae）植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞重組載體引入受體細(xì)胞的方法：轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染具體的方法參見有關(guān)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)第30頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基因工程的應(yīng)用及發(fā)展前景基因工程在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)療、環(huán)保方面的應(yīng)用。基因工程與基本理論研究的關(guān)系。第31頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第五節(jié)微生物菌種的保藏和復(fù)壯衰退與復(fù)壯的概念衰退（degeneration）：在微生物的生長(zhǎng)過(guò)程中，由于變異的存在，使原有的優(yōu)良性狀發(fā)生負(fù)變，即菌種的衰退。

復(fù)壯(rejuvenation)：狹義的復(fù)壯是指在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過(guò)純種分離和生產(chǎn)性能測(cè)定等方法，從衰退的群體中找出未衰退的個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)該菌原有典型性狀的措施；廣義的復(fù)壯是指在菌種的生產(chǎn)性能未衰退前就有意識(shí)的經(jīng)常、進(jìn)行純種的分離和生產(chǎn)性能測(cè)定工作，以期菌種的生產(chǎn)性能逐步提高。實(shí)際上是利用自發(fā)突變（正變）不斷地從生產(chǎn)中選種。第32頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月防止菌種衰退的方法控制傳代的次數(shù)（一般在DNA的復(fù)制過(guò)程中，堿基的錯(cuò)配率是5x10-4，自發(fā)突變的頻率為10-8~10-9，采用良好的菌種保藏方法，可以減少移種和傳代的次數(shù)）創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件利用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行接種傳代：對(duì)絲狀微生物而言，通常采用穩(wěn)定的單核孢子進(jìn)行接種。采用有效的菌種保藏方法第33頁(yè)，課件共38頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月菌種的復(fù)壯措施純種分離

菌落純的分離方法（平板表面涂布法，平板劃線分離法，瓊脂培養(yǎng)基澆注法）

細(xì)胞純的分離方法（分離小室進(jìn)行單細(xì)胞分離，顯微操縱器進(jìn)行單細(xì)胞分離，菌絲尖端切割法進(jìn)行單細(xì)胞分離）通過(guò)宿主體內(nèi)生長(zhǎng)進(jìn)行復(fù)壯（如Bacillusthuringi