黑素皮質(zhì)素受體-4與瘦蛋白調(diào)控肥胖的研究進(jìn)展

黑素皮質(zhì)素受體-4與瘦蛋白調(diào)控肥胖的研究進(jìn)展

mc4r（melac-4receive，黑素物質(zhì)受體-4）是腦實(shí)質(zhì)中從黑素物質(zhì)中排出的一個(gè)個(gè)體物質(zhì)。這是黑素受體家族的五個(gè)亞型（mc1-5r）之一。黑素皮質(zhì)素受體是G-蛋白偶聯(lián)受體(G-proteincoupledreceptors,GPCRs)超家族的成員,是腺苷酸環(huán)化酶途徑中所有的7個(gè)橫跨膜受體,它們的表達(dá)部位和功能都不一樣。MC1R基因被毛色擴(kuò)展基因座所編碼,在黑素細(xì)胞和白細(xì)胞中表達(dá),分別影響毛發(fā)、羽毛及表皮色素沉積和炎癥的發(fā)生。MC2R僅在腎上腺皮質(zhì)和脂肪細(xì)胞中表達(dá),其功能是作為促腎上腺皮質(zhì)素的受體,介導(dǎo)腎上腺類(lèi)固醇生成。MC3R是一個(gè)神經(jīng)受體,主要生理功能是調(diào)節(jié)采食行為和能量平衡,對(duì)動(dòng)物體重有顯著影響。MC4R可與腦部分泌的天然內(nèi)源配體α-促黑激素(alphamelanocyte-stimulatinghormone,α-MSH)結(jié)合,抑制體重的增加。在哺乳動(dòng)物中,MC4R具有介導(dǎo)瘦蛋白(leptin)的功能,是一個(gè)調(diào)節(jié)能量平衡與能量動(dòng)態(tài)平衡的重要信號(hào)分子。MC4R可與其內(nèi)源性配體黑素皮質(zhì)素激素(melanocortin,MC)或刺鼠色蛋白(agoutiprotein,agouti蛋白)和agouti相關(guān)蛋白(agoutirelatedprotein,AGRP)相結(jié)合,從而在控制食欲和體重穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。MC4R的中樞神經(jīng)體重調(diào)節(jié)功能主要為抑制攝食,導(dǎo)致血糖、胰島素和瘦素水平降低,從而減少體脂,降低體重。因此,在人類(lèi)肥胖研究中MC4R作為重要的調(diào)節(jié)因子倍受關(guān)注。最近有研究表明:MC4R的1232位點(diǎn)的G→A的突變與綿羊背膘厚度間存在關(guān)聯(lián),AG和AA型較GG型具有較高的背膘厚度。1mt4r分子模型MC4R由332個(gè)氨基酸殘基組成,是跨膜G蛋白耦聯(lián)受體家族的成員之一,具有7次跨膜結(jié)構(gòu)。其蛋白的N-末端在細(xì)胞外、C-末端在細(xì)胞內(nèi),每?jī)蓚€(gè)跨膜區(qū)形成一個(gè)拌區(qū),MC4R的結(jié)合區(qū)在跨膜區(qū),通常在第3~5和第7跨膜段內(nèi)。跨膜區(qū)是相當(dāng)保守的,在同一類(lèi)受體中幾乎是相同的。研究表明,N-末端和C-末端的第3跨膜段和第2個(gè)胞內(nèi)拌區(qū)是與G蛋白發(fā)生作用的重要位點(diǎn)。在第2、第3胞內(nèi)環(huán)(C2、C3)和羧基末端存在蛋白激酶作用的磷酸化位點(diǎn)。Lagerstrom等發(fā)現(xiàn)MC4R在TM2和TM3之間可以插入金屬鋅,這和其他GPCR相似;通過(guò)他們創(chuàng)造的MC4R分子模型發(fā)現(xiàn)TM3的旋轉(zhuǎn)對(duì)于MC4R的功能是重要的。結(jié)合位點(diǎn)的改變或氨基酸殘基的不同可能引起MC4R功能的改變。MC4R大量存在于動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各個(gè)區(qū)域中,包括大腦皮質(zhì)、丘腦、下丘腦、腦干和脊索。1994年,Mountjoy等通過(guò)原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)大鼠腦內(nèi)MC4R在下丘腦腹內(nèi)側(cè)核(VMH)和弓狀核、中央隆凸和內(nèi)側(cè)系帶核高密度分布,而在下丘腦背內(nèi)側(cè)核和大腦前區(qū)的分布密度較低,通過(guò)限制攝食可上調(diào)上述部位MC4R密度,而通過(guò)攝食誘導(dǎo)肥胖可下調(diào)受體密度?？梢?jiàn),MC4R是神經(jīng)組織特別是下丘腦中占優(yōu)勢(shì)的受體亞型,因此它被認(rèn)為在下丘腦食欲控制過(guò)程中起關(guān)鍵作用。2黑素皮質(zhì)素受體-4mc4r的監(jiān)管機(jī)制2.1小鼠側(cè)腦室-msh和mc4r的相互作用黑素細(xì)胞皮質(zhì)激素(melanocortin,MC)是α-黑素細(xì)胞刺激素(α-melanocytestimulatinghormone,α-MSH)、β-MSH、γ-MSH和ACTH等相關(guān)肽的總稱(chēng),是由大分子多肽前體物質(zhì)———前阿片黑素細(xì)胞皮質(zhì)激素(proopiomelanocortin,POMC)水解后生成的。在小鼠側(cè)腦室中注入α-MSH及其同類(lèi)物MT-Ⅱ(MC3R和MC4R的強(qiáng)激動(dòng)劑),可抑制正常空腹和神經(jīng)肽Y(NPY)刺激時(shí)的小鼠攝食量增多,也可抑制agouti過(guò)度表達(dá)和ob/ob(缺少瘦素)肥胖小鼠的攝食。同時(shí)使用α-MSH的拮抗劑SHU9119,則動(dòng)物的攝食量明顯增加。在小鼠側(cè)腦室內(nèi)注入SHU9119,也可增加其夜間的攝食和空腹的攝食量。對(duì)于剔除MC4R基因的小鼠,對(duì)抑制食欲的激動(dòng)劑MT-Ⅱ則無(wú)反應(yīng),證實(shí)了內(nèi)源性MSH對(duì)攝食的調(diào)節(jié)作用是經(jīng)由MC4R實(shí)現(xiàn)的。因α-MSH和MT-Ⅱ皆為非選擇性MCRs的激動(dòng)劑,Stephen等使用新的選擇性MC4R激動(dòng)劑Ro27-3225,并且為了防止其他的、非特異性的代謝影響,如胃病,采用了對(duì)厭食結(jié)果敏感的行為檢測(cè),發(fā)現(xiàn)大鼠和肥胖db/db小鼠都產(chǎn)生了攝食的劑量依賴(lài)性,進(jìn)一步證實(shí)了MC4R在食物攝取和體重控制方面的重要性。2.2mc4r緩沖2.2.1wmonusoperia型的sossyndrose而非高效刺鼠色蛋白因一種金黃色皮毛的小鼠而得名,這種小鼠除了皮毛顏色呈金黃色外,10~12周會(huì)出現(xiàn)代謝異常,攝食量增加,血糖升高,血清胰島素水平上升,體重增加,并逐漸肥胖,形成小鼠的黃色皮毛肥胖綜合征(theyellowmouseobesesyndrome),亦稱(chēng)Agouti肥胖綜合征。直至1992年,agouti基因被克隆,人們才清楚了其變化的原因。若agouti基因發(fā)生突變,基因結(jié)構(gòu)部分刪除或插入于野生型agouti基因的編碼序列,產(chǎn)生6種顯性agouti等位基因(Ay、Avy、Aiapy、Ahvy、Asy和Aiy),Raly啟動(dòng)子占優(yōu)勢(shì),這樣agouti于全身廣泛表達(dá),拮抗α-MSH和MC1R的結(jié)合,導(dǎo)致合成脫黑素(pheomelanin),動(dòng)物皮毛變黃色;拮抗α-MSH與下丘腦攝食中樞中MC4R的結(jié)合,使小鼠的攝食量比對(duì)照組增加10%~36%,產(chǎn)熱減少,對(duì)熱卡的利用率上升,并逐漸肥胖(肥胖主要是由于脂肪細(xì)胞的增大),體長(zhǎng)也增加。2.2.2胞前體保護(hù)的agrp作用AGRP(agouti相關(guān)蛋白)是aguoti的同類(lèi)物,是MC4R的內(nèi)源性抑制劑,可競(jìng)爭(zhēng)性拮抗α-MSH對(duì)MC3R和MC4R的作用(對(duì)MC5R作用很弱),從而增加食欲和攝食量。Yang等通過(guò)替換MC1R(AGRP非抑制受體)和MC4R的1、2、3胞外環(huán)的氨基末段,檢測(cè)cAMP后證實(shí)2、3胞外環(huán)為AGRP結(jié)合部位。Carrie等首次認(rèn)為AGRP除了可以競(jìng)爭(zhēng)性拮抗α-MSH,還可以直接與MC4R作用,是MC4R的逆向拮抗劑。轉(zhuǎn)基因AGRP過(guò)度表達(dá)的動(dòng)物,在β-actin啟動(dòng)子控制下,肥胖,體長(zhǎng)增加,胰島增大,產(chǎn)生高胰島素血癥和延遲發(fā)生的血糖升高;皮毛的顏色沒(méi)有變化,這是因?yàn)锳GRP作用于MC4R和可能還有MC3R,而不作用于MC1R的緣故;糖皮質(zhì)激素的水平,同agouti廣泛表達(dá)的動(dòng)物一樣,無(wú)明顯的變化。近來(lái),使用具有對(duì)MC4R更強(qiáng)選擇性的拮抗劑(如HS104和HS024)增加了飽食大鼠的白晝攝食量,如長(zhǎng)期在腦室內(nèi)注入這兩種拮抗劑,隨著攝食量的增加,大鼠的體重逐漸增加而致肥胖。在MC4R調(diào)控的研究中,Oosterom等發(fā)現(xiàn)268位密碼子Tyr決定了激動(dòng)劑與拮抗劑的共同選擇性。3mc4r基因在細(xì)胞、動(dòng)物及鼠體內(nèi)的分布MC4R基因突變?cè)诮閷?dǎo)肥胖癥發(fā)生中的作用越來(lái)越受到人們的關(guān)注。理論上認(rèn)為MC4R基因的突變引起的肥胖癥是由于單倍體不足、顯性負(fù)性效應(yīng)、或者兩者的聯(lián)合作用?，F(xiàn)在各物種關(guān)于MC4R基因的研究已經(jīng)全面展開(kāi),并取得了豐碩的研究成果。1993年,Gantz等成功克隆出MC4R并將其定位于人染色體18q21.3。人類(lèi)MC4R編碼基因是一個(gè)由996個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成的單一外顯子。隨后,小鼠、大鼠、豬、雞、牛等MC4R基因也相繼被克隆。MC4R基因在各物種中具有高度的同源性。Haegeman等在克隆牛MC4R基因的同時(shí)發(fā)現(xiàn),牛與人、豬、鼠MC4R基因序列相比較,同源性分別為87%、89%和85%。基因的高同源性提示MC4R基因及其表達(dá)產(chǎn)物功能的高度保守。3.1mc4r基因突變MC4R是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的與人類(lèi)顯性遺傳疾病性肥胖相關(guān)的靶位點(diǎn)。Yeo等和Vaisse等首次在兩例早發(fā)性肥胖患者中發(fā)現(xiàn)了MC4R基因移碼突變后,MC4R在人類(lèi)能量和體重調(diào)節(jié)中的重要性逐漸地被揭示。人MC4R突變研究表明,其顯性遺傳多由于單體不足所導(dǎo)致,在極少數(shù)個(gè)體中也可出現(xiàn)隱性遺傳的錯(cuò)義突變。MC4R基因突變屬常染色體顯性遺傳,因此該基因具有表型的突變?cè)谌巳褐械陌l(fā)生率較高,迄今有近80例MC4R基因突變導(dǎo)致肥胖的病例報(bào)道,據(jù)估計(jì)BMI大于40的極度肥胖人群中有1%~4%是由于MC4R基因突變所致。在人類(lèi)由MC4R基因突變引起的肥胖癥其表現(xiàn)型多種多樣,除了多食、肥胖外,并不伴發(fā)其他的內(nèi)分泌代謝異常,甲狀腺、腎上腺和生殖功能正常,不同于其他類(lèi)型的單基因突變性肥胖。另外,MC4R基因多態(tài)性也可能與體脂分布及脂代謝相關(guān),體型缺陷MC4R導(dǎo)致的肥胖為青少年發(fā)病型,且女性的嚴(yán)重程度高于男性,其中大多數(shù)患者體脂分布有女性化傾向。Rosmond等在瑞典人群中的研究表明,MC4R基因Vall03Ile多態(tài)性與腹內(nèi)脂肪、胰島素水平、血糖水平及脂代謝水平相關(guān)。3.2正常大鼠mc4r+/-大鼠mc4r+/-大鼠mc4rHuszar等(1997)首次證明了MC4R在能量平衡中的關(guān)鍵作用,即敲除MC4R基因(MC4R-/-)的小鼠出現(xiàn)遺傳性肥胖,表現(xiàn)多食、肥胖、胰島素分泌過(guò)多等癥狀。具體為第15周時(shí)(MC4R-/-)雌性大鼠為同胞正常大鼠MC4R+/+體重的2倍,而雄性則為1.5倍,雜合子MC4R+/-大鼠的體重改變介于MC4R-/-與正常大鼠之間。同時(shí),在敲除小鼠中,高血糖和高胰島素的水平與性別有關(guān),兩種情況下雄性比雌性形成更快。3.3mc4r基因多態(tài)性分布豬MC4R基因物理定位于1號(hào)染色體q22~27處,與豬1號(hào)染色體上的數(shù)個(gè)標(biāo)記明顯連鎖,用兩點(diǎn)連鎖分析得到的兩個(gè)離MC4R基因最近的連鎖標(biāo)記是SO3113(0,17.76)和S0082(0.05,14.74)。Kim等通過(guò)序列比較分析,發(fā)現(xiàn)豬MC4R基因第7跨膜結(jié)構(gòu)功能域的一個(gè)高度保守區(qū)內(nèi)一個(gè)突變(G→A)導(dǎo)致相應(yīng)的第298位氨基酸發(fā)生了天冬酰胺代替天冬氨酸的錯(cuò)義突變,并建立了TaqI-PCR-RFLP鑒別豬MC4R基因型方法。對(duì)PIC公司5個(gè)系的商品豬共1800頭進(jìn)行分析,顯示MC4R基因型與一些品系的背膘厚和生長(zhǎng)率以及所有品系的采食量呈強(qiáng)相關(guān),AA基因型背膘比BB基因型薄9%,BB基因型比AA基因型日增重高37g,且差異顯著(P<0.05)。柳麗華等利用PCR-RFLP方法對(duì)野豬、杜洛克豬、長(zhǎng)白豬,及野豬與杜洛克豬的雜交后代、野豬與長(zhǎng)白豬的雜交后代5個(gè)群體242頭豬MC4R基因的遺傳變異進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)MC4R基因擴(kuò)增位點(diǎn)存在TaqⅠ多態(tài)性,不過(guò)野豬、野豬×長(zhǎng)白豬未出現(xiàn)AA基因型,所有群體中C等位基因均以較高頻率存在,野豬最高(0.9167),長(zhǎng)白豬最低(0.5283)。趙曉楓等應(yīng)用PCR-RFLP方法對(duì)金華豬I系(154頭)、金華豬II系(41頭)、金華豬III系(53頭)的MC4R基因的1269~1494bp區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增,并用TaqI酶進(jìn)行酶切,比較了MC4R酶切后基因型頻率分布情況,結(jié)果表明,AA基因型頻率在金華豬上較高,達(dá)0.9194,在II系中最高,達(dá)0.9512,III系次之,達(dá)到0.9434,I系最低,達(dá)0.9026,而金華豬的AB基因型和BB基因型頻率都較低,分別為0.0565和0.0242。楊曉慧等采用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)MC4R基因的298位點(diǎn)錯(cuò)義突變(Asp298Asn)在萊蕪豬、大萊二元雜交豬和商品豬中的多態(tài)性進(jìn)行了檢測(cè),對(duì)該突變與商品豬背膘厚的關(guān)系進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明,在33頭萊蕪豬中只檢測(cè)到11個(gè)基因型,而在大萊二元雜交豬和商品豬中11、12和22基因型均有分布,且等位基因1的頻率均高于等位基因2。商品豬不同基因型個(gè)體背膘厚差異顯著(P<0.05),MC4R基因298位點(diǎn)的Asp298Asn錯(cuò)義突變與商品豬的背膘厚有關(guān),可以作為以西方豬種為雜交親本的商品豬背膘厚的分子標(biāo)記。額爾敦達(dá)古拉(2009)采用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)大白豬、北京黑豬及萊蕪豬MC4R基因D298N突變位點(diǎn)進(jìn)行了多態(tài)性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn):大白豬(引入品種)和北京黑豬(培育品種)含D298N位點(diǎn)等位突變所以瘦肉率高,肌內(nèi)脂肪含量低。MC4R基因D298N突變位點(diǎn)很可能與肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)。以上研究表明MC4R可以作為與豬脂肪沉積性狀及肉質(zhì)性狀相關(guān)的候選基因。3.4mc4r基因多態(tài)性與體重相關(guān)性研究巴彩鳳等成功構(gòu)建了犬MC4R原核表達(dá)載體,此重組體能在E.coliBL21內(nèi)表達(dá)犬MC4R融合蛋白,為進(jìn)一步獲取犬MC4R的單克隆抗體奠定了物質(zhì)基礎(chǔ),也為研究犬MC4R蛋白的結(jié)構(gòu)和生理功能提供了幫助。張軼博等分析了比格犬黑素皮質(zhì)素受體-4基因多態(tài)性與犬體重的關(guān)系,結(jié)果在比格犬MC4R基因中發(fā)現(xiàn)2處單堿基缺失突變,1個(gè)單堿基顛換變異,存在PshAⅠ酶切位點(diǎn),并基于PshAⅠ酶切位點(diǎn)建立了PCR-RFLP技術(shù)。統(tǒng)計(jì)分析顯示犬MC4R基因型與體重顯著相關(guān),可以考慮將MC4R基因作為犬體重的候選基因。巴彩鳳等克隆了犬MC4R基因片段,并尋找其多態(tài)性位點(diǎn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)錦州本地犬MC4R基因片段有2處A堿基缺失突變。表明本地犬中存在MC4R基因的多態(tài)性。3.5mc4r基因在京海黃雞群體中的多態(tài)性李國(guó)輝等利用PCR-SSCP和DNA測(cè)序的方法,對(duì)京海黃雞雞群MC4R基因多態(tài)性進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)存在2個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn),分別為第662位堿基G→C點(diǎn)突變和第733~734位堿基間插入一個(gè)C堿基。陶勇等以140只京海黃雞為試驗(yàn)材料,以MC4R為候選基因,采用PCR-SSCP和DNA測(cè)序技術(shù)分析了MC4R基因在京海黃雞群體中的多態(tài)性。結(jié)果表明:MC4R基因編碼區(qū)第662bp處有G→C堿基的點(diǎn)突變,在京海黃雞中檢測(cè)到AA、AB、BB三種基因型,由此推測(cè),MC4R基因可能對(duì)于雞生長(zhǎng)性能具有很大的影響或與控制生長(zhǎng)性能的主基因連鎖?；裘鳀|等以高低脂雙向選擇肉雞品系為研究材料,采用PCR-SSCP和測(cè)序方法檢測(cè)MC4R基因編碼區(qū)的SNPs,結(jié)果在編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)1個(gè)G315T的突變。推測(cè)MC4R基因可能是影響雞早期生長(zhǎng)和肌肉性狀的主效基因或與主效基因相連鎖。仇雪梅等利用PCR-SSCP和DNA測(cè)序的方法,對(duì)資源家系F2代雞群MC4R基因多態(tài)性進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)存在4個(gè)單核苷酸多態(tài)(singlenucleotidepolymorphisms,SNPs)位點(diǎn)。表明MC4R基因可以作為影響和控制雞體重、生長(zhǎng)等屠體性狀的主要候選基因。3.6mc4r基因的突變及其定位Haegeman等對(duì)牛的MC4R基因的cDNA進(jìn)行了克隆并測(cè)序。結(jié)果表明,在DNA水平上,牛的MC4R基因與人、豬、鼠的同源性分別達(dá)到87%、85%和89%,在蛋白質(zhì)水平,同源性都超過(guò)90%。通過(guò)單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)發(fā)現(xiàn)有2個(gè)核苷酸發(fā)生改變:T和G分別被替換成C和A,保守的纈氨酸被替換成丙胺酸(Val145Ala),丙胺酸被替換成蘇氨酸(Ala172Thr)。Thue等通過(guò)對(duì)加拿大肉牛的遺傳圖譜研究,將牛的MC4R基因最終定位在牛的24號(hào)染色體上(BTA24)。張菊研究表明:MC4R的1232位點(diǎn)的G→A的突變與綿羊背膘厚度間