DNA和RNA提取原理和方法

核酸提取及常見(jiàn)問(wèn)題分析主講人：劉召華唐維（修改）第一部分：DNA提取方法簡(jiǎn)介第二部分：DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策內(nèi)容第三部分：RNA提取方法簡(jiǎn)介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常見(jiàn)問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策

核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象，因此核酸的提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最重要、最基本的操作。前言第一部分：DNA提取方法簡(jiǎn)介第二部分：DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策第三部分：RNA提取方法簡(jiǎn)介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常見(jiàn)問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策第一部分：DNA提取方法簡(jiǎn)介DNA提取的幾種方法基因組DNA的提取

CTAB法

SDS法其它DNA提取的幾種方法

非基因組DNA的提取

質(zhì)粒DNA的提取

堿裂解法煮沸法

線粒體、葉綠體DNA的提取

差速離心結(jié)合SDS裂解法基因組DNA－CTAB法

CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽(yáng)離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。具有從低離子強(qiáng)度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在這種條件下，蛋白質(zhì)和中性多聚糖仍留在溶液里該復(fù)合物在高鹽溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通過(guò)有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類(lèi)等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來(lái)。注：CTAB溶液在低于15℃

時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15℃。

CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方

組份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巰基乙醇

終濃度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl

提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP（脫氧核糖核蛋白）。CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除基因組DNA－CTAB法褐變

CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方

組份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巰基乙醇

終濃度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖?；蚪MDNA－CTAB法PVP（聚乙烯吡咯烷酮）PVP按其平均分子量大小分為四級(jí)，習(xí)慣上常以K值表示，不同的K值分別代表相應(yīng)的PVP平均分子量范圍。K值實(shí)際上是與PVP水溶液的相對(duì)粘度有關(guān)的特征值，而粘度又是與高聚物分子量有關(guān)的物理量，因此可以用K值來(lái)表征PVP的平均分子量。通常K值越大，其粘度越大，粘接性越強(qiáng)。

在研磨過(guò)程中加入PVP，其中的CO-N=基有很強(qiáng)的結(jié)合多酚的能力，從源頭上減少了酚類(lèi)被氧化的機(jī)會(huì)。同時(shí)向抽提液中加入還原劑β-巰基乙醇，后者能打斷多酚氧化酶中的二硫鍵，使多酚不易被氧化，隨后經(jīng)抽提而去除。

CTAB法流程圖植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細(xì)胞裂解干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液基因組DNA－CTAB法

SDS法原理基因組DNA－SDS法SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（55～65℃）條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰?。?，使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。組份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）

NaClSDS終濃度10mM20mM0.4M2%

SDS法DNA提取緩沖液2.65水浴60min,其間緩慢搖動(dòng)幾次。3.加入150ul的5mol/LKac,混勻,冰浴15min左右SDS法流程圖

（以動(dòng)物組織為例）

動(dòng)物組織細(xì)胞裂解上層溶液組織勻漿抽提干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液基因組DNA－SDS法基因組DNA－其它方法物理方式：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法化學(xué)方式：異硫氰酸胍法、堿裂解法生物方式：酶法

根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有：基因組DNA－其它方法吸附材料結(jié)合法：

根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：硅質(zhì)材料

陰離子交換樹(shù)脂磁珠

高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫?？旖莞咝?。低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的?；蚪MDNA－其它方法濃鹽法：

有機(jī)溶劑抽提法：

密度梯度離心法：

利用RNP和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑，同時(shí)抑制核酸酶的降解作用利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物質(zhì)粒DNA－堿裂解法堿裂解法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；當(dāng)用堿處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過(guò)離心將兩者分開(kāi)。質(zhì)粒DNA－堿裂解法堿裂解法流程圖對(duì)數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解上清液抽提離心洗滌酒精沉淀干燥溶解沉淀質(zhì)粒DNA溶液SDS堿裂解法提取質(zhì)粒DNA中溶液1的成分及作用溶液Ⅰ50mM葡萄糖/10mMEDTA/25mMTris-HCl，pH=8.0葡萄糖增稠，使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部；EDTA抑制DNase的活性。這一步溶液中還可以加入RNase，不受EDTA影響，并且可以在后續(xù)步驟中被除去溶液Ⅱ0.2MNaOH/1%SDS破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。溶液III3M醋酸鉀/2M醋酸這一步的K置換了SDS（十二烷基磺酸鈉）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸鉀）沉淀；SDS易與蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)也沉淀了，同時(shí)基因組DNA也被PDS共沉淀質(zhì)粒DNA－煮沸法煮沸法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；當(dāng)加熱處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過(guò)離心將兩者分開(kāi)。細(xì)胞器DNA－差速離心法差速離心法原理是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細(xì)胞器，自身可編碼蛋白，它們的比重和大小一定，因而在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級(jí)分離出來(lái)。第一部分：DNA提取方法簡(jiǎn)介第二部分：DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策內(nèi)容第三部分：RNA提取方法簡(jiǎn)介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常見(jiàn)問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策第二部分：DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策DNA提取的基本步驟I.材料準(zhǔn)備II.破碎細(xì)胞或包膜－內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中材料準(zhǔn)備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組DNA時(shí)，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）組培細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取使用處于對(duì)數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開(kāi)環(huán)質(zhì)粒增加）培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）嚴(yán)謹(jǐn)性質(zhì)粒和松弛性質(zhì)粒按照復(fù)制性質(zhì)，可以把質(zhì)粒分為兩類(lèi)：一類(lèi)是嚴(yán)緊型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時(shí)，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有1～2個(gè)質(zhì)粒；另一類(lèi)是松弛型質(zhì)粒，當(dāng)染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制，每一個(gè)細(xì)胞內(nèi)一般有20個(gè)左右質(zhì)粒。一般分子量較大的質(zhì)粒屬?lài)?yán)緊型。分子量較小的質(zhì)粒屬松弛型。質(zhì)粒的復(fù)制有時(shí)和它們的宿主細(xì)胞有關(guān)，某些質(zhì)粒在大腸桿菌內(nèi)的復(fù)制屬?lài)?yán)緊型，而在變形桿菌內(nèi)則屬松弛型。細(xì)胞裂解材料應(yīng)適量，過(guò)多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低針對(duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料－－液氮研磨動(dòng)物組織－－勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞－－蛋白酶K細(xì)菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取菌體量適當(dāng)培養(yǎng)基去除干凈，同時(shí)保證菌體在懸浮液中充分懸浮變性的時(shí)間不要過(guò)長(zhǎng)（5分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷復(fù)性時(shí)間也不宜過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)有基因組DNA的污染G＋菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機(jī)械法處理，以破壁核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時(shí)，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間（獼猴桃大提，10000轉(zhuǎn)20min）針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過(guò)程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取核酸分離、純化蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌蛋白酶處理多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5MNaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。核酸分離、純化多酚的去除：在抽提液中加入防止酚類(lèi)氧化的試劑：β-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類(lèi)結(jié)合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類(lèi)有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類(lèi)與DNA的結(jié)合核酸分離、純化鹽離子的去除：70％的乙醇洗滌核酸沉淀、溶解當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分沉淀時(shí)加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過(guò)分干燥）若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取DNA中含有蛋白、多糖、多酚類(lèi)雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見(jiàn)前）重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題問(wèn)題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。

原因?qū)Σ卟牧喜恍迈r或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過(guò)程操作過(guò)于劇烈，DNA被機(jī)械打斷外源核酸酶污染反復(fù)凍融