枳實(shí)消痞丸對胃癌sgc-7501細(xì)胞增殖和凋亡的影響

枳實(shí)消痞丸對胃癌sgc-7501細(xì)胞增殖和凋亡的影響

癌癥是人類健康中常見的腫瘤之一。枳實(shí)消痞丸是治療胃癌和胃癌前病變的有效方劑,出自李東垣的《蘭室秘藏》。從枳實(shí)消痞丸中藥物的組成看,本方是由枳術(shù)湯、半夏瀉心湯、四君子湯3方加減化裁而成。綜觀全方,消補(bǔ)兼施,寒熱并用,為行氣消痞良劑。流式細(xì)胞儀(flowcytometry,FCM)將激光光學(xué)技術(shù)、流體噴射技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)和電子技術(shù)等集于一體,優(yōu)越性強(qiáng),既可定量又可定性,且具有快速、簡單和敏感性高的特點(diǎn),還可進(jìn)行多參數(shù)和活體細(xì)胞分析。筆者應(yīng)用流式細(xì)胞儀觀察枳實(shí)消痞丸3個(gè)不同質(zhì)量濃度誘導(dǎo)體外人胃腺癌細(xì)胞SGC-7901凋亡和周期的情況,并探討其作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。1材料表面1.1茯苓人參化學(xué)地層枳實(shí)消痞丸原方組成:干生姜∶炙甘草∶麥芽曲∶白茯苓∶白術(shù)∶半夏曲∶人參∶炙厚樸∶枳實(shí)∶黃連1∶2∶2∶2∶2∶3∶3∶4∶5∶5。藥物購于河南中醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院。經(jīng)中藥鑒定學(xué)科鑒定為正品。1.2細(xì)胞植物中分化胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901(鄭州生物工程技術(shù)研究中心)。1.3細(xì)胞凋亡檢測試驗(yàn)胎牛血清(Hyclone),DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco),DMSO(Amresco),MTT(Sigma),AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞DNA含量檢測試劑盒(凱基生物公司)。1.4實(shí)驗(yàn)儀器和儀器Heraeus細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國Kendro),紫外分光光度計(jì)(BioMate),倒置顯微鏡(ZESS),ELx800型酶標(biāo)儀(Bio-Tek),SG-603生物安全柜(Bake),FACSCalibur型流式細(xì)胞儀(BD)。2方法2.1藥汁的制備應(yīng)用蒸餾水煎煮,武火煮沸,文火20min,煎煮2次,合并2次煎煮的藥汁,按1∶1的比例加入95%乙醇,4℃冰箱靜置24h,收集上清液,過濾、回收乙醇,干燥,冷藏備用。體外實(shí)驗(yàn),用不含血清培養(yǎng)基稀釋,過濾除菌,根據(jù)不同的需要調(diào)整藥物濃度。2.2培養(yǎng)基的使用生長于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱,每間隔48h更換1次培養(yǎng)基,試驗(yàn)時(shí),消化,并接種于96孔板中或6孔板培養(yǎng)皿中。2.3抑制率測定以1×104細(xì)胞/孔接種96孔平面培養(yǎng)板,于37℃,5%CO2,飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。設(shè)陰性對照組、枳實(shí)消痞丸藥物組。藥物組分別設(shè)置質(zhì)量濃度為:4,2,0.5,0.125,0.05g·L-1,每組4個(gè)復(fù)孔;陰性對照為完全培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24,48,72h,加入MTT,用酶標(biāo)儀在波長為570nm(/630nm),測定吸光度(A)。按公式計(jì)算抑制率。抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)孔平均A570/630/對照孔平均A570/630)×100%2.4枳實(shí)消手術(shù)細(xì)胞的分離培養(yǎng)按照AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒要求進(jìn)行,簡而言之,SGC-7901細(xì)胞(1×105個(gè))接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,放入37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中24h,分別加入枳實(shí)消痞丸的高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度(胃癌SGC-7901細(xì)胞2,0.5,0.125g·L-1),陰性對照組只加培養(yǎng)液,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48,72h,收獲細(xì)胞,按凋亡試劑盒說明處理細(xì)胞,FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測,CELLQuest軟件獲取并分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。2.5facscarlihens檢測實(shí)驗(yàn)分組及收集細(xì)胞方法同2.4;嚴(yán)格按照細(xì)胞DNA含量檢測試劑盒說明進(jìn)行樣品處理,200目篩網(wǎng)過濾后,經(jīng)FACSCaliber流式細(xì)胞儀檢測,CELLQuest軟件獲取,ModFitLT3.2軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。2.6基于lsd-t檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,使用SPSS17.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行ANOVA方差分析后,再進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn),測P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,進(jìn)行回歸分析進(jìn)行曲線擬合,應(yīng)用概率法計(jì)算半數(shù)抑制率。3結(jié)果3.1不同7%的枳實(shí)消手術(shù)作用回歸分析法24h:UY=11.812X+8.125,48h:Y=16.76X+13.183,72h:Y=16.371X+19.691;應(yīng)用概率法95%置信區(qū)間IC5024h為3.530g·L-1,48h為2.212g·L-1,72h為1.817g·L-1。可見枳實(shí)消痞丸對細(xì)胞的抑制呈現(xiàn)明顯的時(shí)效關(guān)系。見表1。從抑制率分析,筆者選擇了48,72h2個(gè)時(shí)間點(diǎn)和2,0.5,0.125g·L-13個(gè)濃度進(jìn)行流式細(xì)胞儀凋亡和周期的檢測。3.2細(xì)胞早期凋亡從表2可以看出:早期和晚期凋亡,枳實(shí)消痞丸各濃度組與陰性對照組比較,高、中濃度作用的細(xì)胞早期凋亡率均顯著增加(P<0.05),且低濃度組與中、高濃度組差異明顯(P<0.05)。同濃度作用48,72h凋亡率比較,作用72h比作用48h的明顯增高(P<0.05)。3.3血清dna含量從表3可以看出,枳實(shí)消痞丸各濃度組作用SGC-7901細(xì)胞48h和72h后,G1/G0期細(xì)胞DNA含量較陰性對照組比較,高、中濃度組增高(P<0.05),低濃度組沒有顯著差異;S期細(xì)胞DNA含量高濃度較陰性對照組減少(P<0.05),且明顯低于低濃度組(P<0.05),中、低濃度組沒有區(qū)別;G2/M期DNA含量除低濃度作用48h與陰性對照組比較無顯著差異外,其他均較陰性對照組顯著減少(P<0.05),且高、中濃度明顯低于低濃度組(P<0.05)。同濃度比較,除了在G2/M期高低濃度作用的細(xì)胞72h較48h相應(yīng)降低外,其他均無顯著差別。4枳實(shí)消手術(shù)抑制gsc-9.2細(xì)胞凋亡中藥復(fù)方枳實(shí)消痞丸是臨床常用行氣消痞有效方劑,廣泛用于多種胃腸疾病,并取得滿意的療效。該方臨床療效顯著,安全可靠,值得研究。MTT法可以檢測細(xì)胞的存活和生長狀況。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法對枳實(shí)消痞丸作用24,48,72h后的SGC-7901細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)檢測,結(jié)果顯示枳實(shí)消痞丸對SGC-7901細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用,且表現(xiàn)出劑量和時(shí)間依賴性。隨著藥物濃度的減少,其抑制率依次降低。以藥物濃度為2g·L-1來看,隨著時(shí)間的延長,其抑制率依次升高。為了進(jìn)一步研究枳實(shí)消痞丸抑制細(xì)胞生長的機(jī)制,筆者觀察了該方對胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡影響。細(xì)胞周期是指連續(xù)分裂細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂結(jié)束所經(jīng)歷的整個(gè)過程。細(xì)胞周期各時(shí)相的DNA含量不同,正常細(xì)胞的G1/G0期具有二倍體細(xì)胞的DNA含量,而G2/M期具有四倍體細(xì)胞的DNA含量,而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。按照DNA含量的不同,可將細(xì)胞周期各時(shí)相區(qū)分為G1/G0期,S期和G2/M期。熒光染料碘化丙啶(PI)是一種插入性核酸熒光染料,但不能穿過完整的細(xì)胞膜。用乙醇固定細(xì)胞,使PI可以進(jìn)入細(xì)胞并與核酸結(jié)合。用流式細(xì)胞術(shù)可以檢測DNA結(jié)合PI的熒光強(qiáng)度反映出胞內(nèi)DNA的含量,可計(jì)算出G1/G0期、S期和G2/M期的細(xì)胞百分比。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示:與陰性對照組相比,枳實(shí)消痞丸高、中濃度組所作用的細(xì)胞在G1/G0期的比率明顯增加,處于S期和G2/M期細(xì)胞比率相應(yīng)減少,說明枳實(shí)消痞丸在G1/G0期阻滯了SGC-7901細(xì)胞DNA的合成,從而抑制細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞的G1期,可以合成mRNA,tRNA,rRNA和核蛋白體,從而為DNA的合成做準(zhǔn)備。枳實(shí)消痞丸使G1期細(xì)胞比率增高,可能由于過多細(xì)胞受損過重,超過了自身的修能力,難以通過G1/S期檢查點(diǎn),從而抑制細(xì)胞增殖。凋亡稱為程序性死亡,它與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),許多癌基因與抑癌基因都參與細(xì)胞凋亡的過程,一些天然藥物提取物可通過干預(yù)細(xì)胞凋亡起到治療作用。流式細(xì)胞儀用于檢測細(xì)胞凋亡具有其他方法不可比擬的優(yōu)越性,既可定量又可定性,且具有操作快速、簡單和靈敏性高等優(yōu)點(diǎn)。流式細(xì)胞儀通常根據(jù)細(xì)胞膜的完整性將細(xì)胞分為“死”細(xì)胞和“活”細(xì)胞,因此凋亡細(xì)胞和正常細(xì)胞歸為活細(xì)胞。AnnexinV與PI匹配使用,就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分