柑橘青龍病的診斷技術(shù)

柑橘青龍病的診斷技術(shù)

中國是世界上重要的柑橘生產(chǎn)國，生產(chǎn)面積第一，產(chǎn)量達(dá)到世界第二。但在柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展當(dāng)中,病蟲害嚴(yán)重制約了發(fā)展速度,特別是柑橘黃龍病(citrushuanglongbing,HLB)。由于柑橘種類、品種繁多,砧穗組合比較復(fù)雜,而且,即使是同一品種甚至同一植株,在自然情況下可感染多種病害,而不同的病害又有不同的癥狀,所以加大了其田間診斷的難度。因此,發(fā)展快速靈敏的柑橘黃龍病的檢測技術(shù),準(zhǔn)確、快速地診斷柑橘黃龍病,是柑橘檢疫、脫毒與流行學(xué)研究中的重要問題。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的快速發(fā)展,柑橘黃龍病的檢測技術(shù)有了很大的發(fā)展,現(xiàn)概述如下:1黑駁岸的鑒定癥狀鑒別是最簡便,也是最為直接的一種診斷方法。通過黃龍病發(fā)病癥狀觀察進(jìn)行初步診斷。黃龍病最初表現(xiàn)為樹冠上出現(xiàn)幾條黃梢,以后黃梢的數(shù)量不斷增多直至整株黃化枯死。黃梢上的葉片既可以是大面積均勻一致的黃化,也可以是黃綠相間的斑駁,秋末后病葉陸續(xù)脫落。極少數(shù)可以結(jié)果。病果小,光滑而無光澤,味酸,果臍常偏離,果皮黃綠不均,有的蒂部橙黃,其余為青色,稱為“紅鼻果”。但在所有的癥狀當(dāng)中,斑駁黃化葉片和“紅鼻果”是最具有特征性的癥狀,可以作為形態(tài)學(xué)鑒定該病害的主要依據(jù)。同時(shí),在觀測脫毒苗木的時(shí)候要注意把果樹本身的生理障礙、機(jī)械損傷、蟲害和藥害與黃龍病的癥狀區(qū)分開來。2主家建議植物所謂的指示植物是指受某種病原物侵染后,能表現(xiàn)出具有特征性癥狀的植物。柑橘黃龍病的指示植物,南非專家建議采用伏令夏橙或奧蘭多桔柚,而中國專家建議柑和甜橙。柑感病后新梢呈典型的均勻黃化或斑駁型黃化癥狀,潛伏期較短,接種方法采用多芽枝段腹接法,即在一株指示植物上同時(shí)腹接2個(gè)以上病枝。在2～3月進(jìn)行接種可獲的比其他時(shí)間接種更好的效果。3黃秋葵在生理研究中的應(yīng)用顯微鏡觀測法指的是直接在顯微鏡下對(duì)黃龍病菌的形態(tài)、大小進(jìn)行觀測。顯微鏡觀察大多應(yīng)用電子顯微鏡觀察,由于電鏡本身檢測技術(shù)上的缺點(diǎn)和黃龍病菌在植物體內(nèi)的菌量低、分布不均等原因,電鏡檢測技術(shù)檢測效率只有60%～70%,容易造成漏檢。所以電子顯微鏡檢測技術(shù)多是用來觀測病原體的結(jié)構(gòu)等,很少直接用來作病害檢測。此外有用普通光學(xué)顯微鏡與熒光顯微鏡對(duì)黃龍病病原進(jìn)行檢測的。用FBA染色后,利用普通顯微鏡可以對(duì)植株病原進(jìn)行觀測,但效果只限制于新梢葉片與嫩枝。利用熒光顯微鏡亦可觀測到黃龍病的病原,但局限于充分成熟葉片。這兩種觀測方法也很少用作黃龍病檢測。4光素、酶標(biāo)記和電子顯微鏡的結(jié)合血清學(xué)檢驗(yàn)是最為常見的一種病毒檢測的方法,原理是抗原和抗體的體外結(jié)合,產(chǎn)生特異性沉淀(試管沉淀、微量沉淀、凝膠擴(kuò)散)對(duì)病毒進(jìn)行檢測的一種技術(shù)。同時(shí)為了提高檢測的靈敏度,也可以應(yīng)用熒光素、酶標(biāo)記或在電子顯微鏡下直接觀測抗原和抗體的結(jié)合。血清學(xué)檢測的特點(diǎn)是特異性強(qiáng),靈敏度高,操作簡單,但在應(yīng)用的同時(shí)必須有優(yōu)質(zhì)的血清和抗血清。血清檢測法優(yōu)點(diǎn)明顯但并不是淘汰了汁液法檢測的技術(shù),一般利用血清法進(jìn)行檢測是和汁液法結(jié)合使用的。雖然血清學(xué)檢測已在其它病害的檢測上獲得了巨大的成功,但對(duì)黃龍病病原來講,至今仍沒有得到較好的抗體,在檢測的時(shí)候容易造成漏檢或假陰性。所以利用血清學(xué)進(jìn)行黃龍病檢測還有待進(jìn)一步的發(fā)展,特別是針對(duì)解決現(xiàn)在黃龍病抗體制備復(fù)雜、檢測范圍窄等問題。在免疫血清的基礎(chǔ)上,利用單克隆檢測黃龍病,能有效提高診斷黃龍病的準(zhǔn)確性及靈敏度。5pcr檢測部分聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR),是通過設(shè)計(jì)一定的引物,在體外對(duì)DNA高效合成的一項(xiàng)技術(shù)。PCR技術(shù)使分子生物學(xué)方法達(dá)到了驚人的改變,包括病毒的檢測技術(shù)。一般對(duì)植物病毒進(jìn)行檢測的時(shí)候,只要知道病毒DNA特有的或是保守區(qū)域的序列,就可以通過此序列設(shè)計(jì)出該病毒特異的引物,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)某種病毒的特異性檢測?？旖?靈敏,方便,廉價(jià)是其技術(shù)的特點(diǎn)。自Villechanoux等發(fā)表了柑橘黃龍病病原的部分DNA序列以來,PCR檢測黃龍病的技術(shù)得到了巨大發(fā)展。常用的PCR檢測技術(shù)有常規(guī)PCR、定量PCR和巢式PCR(Nested-PCR)三種。5.1種病料的pcr檢測Jagoueix、Hocquellet等采用常規(guī)PCR技術(shù)分別對(duì)黃龍病亞洲種和非洲種進(jìn)行了檢測,發(fā)現(xiàn)常規(guī)PCR技術(shù)可以較好的區(qū)分兩種病原。丁芳等(2004)利用常規(guī)PCR技術(shù)檢測了田間和廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所幾個(gè)感黃龍病品種,發(fā)現(xiàn)其可以檢測出未顯癥狀的黃龍病材料。5.2定量pcr檢測定量PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。定量PCR技術(shù)不僅可以檢測到黃龍病病原,同時(shí)可以檢測出病原含量多少。田亞南等(1996)報(bào)道,運(yùn)用定量PCR檢測技術(shù),在木虱體內(nèi)病原含量最多,其次為長春花,而柑橘中病原體相對(duì)較少。胡浩等(2006)建立了兩種熒光定量PCR方法,可以為柑橘黃龍病的早期診斷以及柑橘黃龍病病原菌近緣種提供準(zhǔn)確、靈敏、快速的檢驗(yàn)檢疫技術(shù)。5.3內(nèi)側(cè)二次pcr反應(yīng)普通PCR基礎(chǔ)上衍生出的巢式PCR(nestedPCR)技術(shù)能有效提高PCR的特異性和靈敏度,其原理是針對(duì)目的基因區(qū)域設(shè)計(jì)兩對(duì)引物,即一對(duì)外側(cè)引物和一對(duì)內(nèi)側(cè)引物,內(nèi)側(cè)引物擴(kuò)增片段比外側(cè)的稍短并完全位于外側(cè)引物擴(kuò)增區(qū)域內(nèi),這樣通過先外側(cè)后內(nèi)側(cè)二次PCR反應(yīng)對(duì)特定DNA片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增。自Harakava等首次運(yùn)用Nested-PCR技術(shù)對(duì)柑橘黃龍病進(jìn)行檢測后,其以高的靈敏度得到廣泛的推廣。李韜等發(fā)現(xiàn)利用該技術(shù)可以檢測到單頭帶菌木虱。丁芳比較了常規(guī)PCR和Nested-PCR技術(shù)在檢測上的靈敏度,發(fā)現(xiàn)常規(guī)PCR所能檢測到的最低DNA量為pg數(shù)量級(jí),Nested-PCR檢測病原DNA數(shù)量級(jí)約為常規(guī)PCR的104倍。6非洲麻黃病探針檢測DNA雜交技術(shù)是根據(jù)兩條互補(bǔ)的核苷酸單鏈可以雜交結(jié)合成雙鏈的原理所建立,用一段已知序列的放射性或非放射性標(biāo)記的核苷酸單鏈做探針,與待檢標(biāo)本中的DNA雜交來探查待檢標(biāo)本中有無與之相互補(bǔ)的核酸。Garnier等首先利用斑點(diǎn)雜交技術(shù)成功檢測了印度等地的亞洲黃龍病,但是不能很好的檢測非洲黃龍病病株,后又開發(fā)了非洲黃龍病探針。Jagoueix等利用32P和GIG探針證實(shí)了亞洲黃龍病和非洲黃龍病在各地的分布。DNA探針檢測準(zhǔn)確性達(dá)到電鏡檢測的水平,靈敏度達(dá)到檢測單頭木虱的水平。綜上所述,顯微鏡檢查對(duì)柑橘黃龍病容易造成漏檢與假陰性,血清學(xué)檢測的方法上存在檢測