第十九章 基因工程抗體與導(dǎo)向藥物

第十九章

基因工程抗體與導(dǎo)向藥物

一、抗體的基因結(jié)構(gòu)和重排二、基因工程抗體的構(gòu)建和類型三、基因工程抗體的表達(dá)四、導(dǎo)向藥物五、基因工程抗體的導(dǎo)向生物治療一、抗體的基因結(jié)構(gòu)和重排（一）重鏈V區(qū)基因人類VH（119）-D（30）-J（9）（二）輕鏈基因的結(jié)構(gòu)和重排如圖19-2κ鏈：Vκ（100）、Jκ（5）、Cκ（1）λ鏈：Vλ（100）Jλ（6）Cλ（6）（三）重鏈C區(qū)基因如圖19-3Cμ-Cδ-Cγ3-Cγ1-Cε2-Cα1-Cγ2-Cγ4-Cε-Cα2（四）人源性單抗的抗體組合文庫技術(shù)（原理）1．mRNA的提取2．RT-PCR制備cDNA3．抗體組合文庫技術(shù)4．噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)（phagedisplaytechnology）5．陽性克隆的篩選二、基因工程抗體的構(gòu)建和類型(一)嵌合抗體(ChimericAntibody)

(二)人源化抗體(Humanigedantibody)

(三)小分子抗體（四）人源性單抗的抗體組合文庫技術(shù)（一）嵌合抗體鼠Ig的V區(qū)與人Ig的恒定區(qū)（C區(qū)）基因重組后，在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中表達(dá)，這種嵌合抗體含75～80%人抗體，20%鼠抗體,注入人體后可減少人抗鼠抗體的反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是減少了鼠單抗的免疫原性，另外人抗體C區(qū)仍可有效地發(fā)揮補(bǔ)體激活和與FC受體結(jié)合的生物學(xué)活性，在構(gòu)建時(shí)可以有目的地選擇抗體類型，可有效地發(fā)揮抗體的生物效應(yīng)，已有多種針對不同抗原的嵌合抗體的報(bào)道、但多為IgG1亞類。（二）人源化抗體為了減少嵌合抗體中鼠源性序列，人們又將鼠抗體V區(qū)（H、L鏈）中的3個(gè)超變區(qū)基因插入人抗體的V區(qū)的框架（FR）基因中，這樣構(gòu)建的抗體保留了鼠抗體與抗原結(jié)合的特異性。這種抗體幾乎百分之百人源化了。目前針對不同抗原如腫瘤相應(yīng)抗原、細(xì)胞表面受體、細(xì)胞因子等，已構(gòu)建了許多種人源化基因工程抗體。(三)小分子抗體

（1）單鏈抗體(SingleChainFvScFv)（2）重組Fab片斷（3）單域結(jié)構(gòu)VH或VL

（4）雙特異性抗體（5）免疫粘連素（6）催化抗體單鏈抗體單鏈抗體(SingleChainFvScFv);它是由抗體重，輕鏈的可變區(qū)基因(VH、VL)之間通過一段編碼連接肽基因，拼接后表達(dá)形成的重組蛋白。是一種具有抗原結(jié)合能力的最小抗體片段，可在一些不需Fc段效應(yīng)功能的實(shí)際應(yīng)用中開展研究和應(yīng)用。其優(yōu)點(diǎn)是分子量小，易于穿透組織到達(dá)靶器官發(fā)揮功效，易于構(gòu)建和生產(chǎn)，但易于被清除。重組Fab片斷重組Fab片斷是單價(jià)的VH-CH（Fd）和輕鏈的VL-CL兩個(gè)片斷由二硫鍵連接而成。它具有與抗體相同的抗原結(jié)合活性，其特點(diǎn)是結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，制作簡便。細(xì)菌表達(dá)的Fab與酶解Ig后所獲得的Fab具有相同的功能。單域結(jié)構(gòu)VH或VL分別由單域VH或VL采用基因工程法構(gòu)建的抗體組成，該類抗體構(gòu)建簡便，鑒于在抗原結(jié)合部位中，VH作用比VL大，大多數(shù)單獨(dú)的VH保留了較好的抗原結(jié)合能力和專一性，單獨(dú)VL抗體因只有一個(gè)功能區(qū)而沒有抗原結(jié)合能力，無應(yīng)用價(jià)值，因此單域VH抗體在制備和應(yīng)上有其優(yōu)點(diǎn)，然而由于暴露了原先與VL結(jié)合的疏水性，使其特異性降低，還需對VH片斷做一些結(jié)構(gòu)改造才能應(yīng)用。雙特異性抗體雙特異性抗體：將兩個(gè)抗體的重鏈和輕鏈V區(qū)基因的重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中表達(dá)，或用肽鏈連接物連接兩種不同特異性抗體的可變區(qū)基因，構(gòu)建單肽雙特異性抗體。如：將抗腫瘤細(xì)胞EGFR的Fab與抗T細(xì)胞CD3的Fab組成雙特異性抗體，有助于介導(dǎo)T細(xì)胞殺腫瘤（連接效-靶細(xì)胞）（如圖19-4）?？估w維蛋白的ScFv-tPA基因連接，有助于與血栓中的纖維蛋白結(jié)合，使tPA定位溶解血栓，此外還可作為載體將毒素、核酸、藥物、定位于靶細(xì)胞，發(fā)揮治療腫瘤和心血管疾病。免疫粘連素抗體恒定區(qū)（C區(qū)）N-端基因連接人細(xì)胞受體（CD4-FC）或粘附分子基因在真核細(xì)胞中表達(dá)正確折疊的抗體樣融合蛋白（稱免疫粘連素），，N端為同一種分子稱為同源二聚體結(jié)構(gòu)。N端為兩種不同的分子稱異源二聚體結(jié)構(gòu)。一方面可發(fā)揮抗體效應(yīng)，另一方面N端CD4為T細(xì)胞亞類糖蛋白，又是HIV受體，CD4可與HIV結(jié)合由FC活性殺滅HIV，可阻斷HIV感染T細(xì)胞。催化抗體基因工程催化抗體是通過在輕鏈V區(qū)插入能與金屬離子結(jié)合的氨基酸序列，再與重鏈V區(qū)重組，使重鏈V區(qū)識別抗原，并選擇性地結(jié)合底物，輕鏈則可通過促進(jìn)底物反應(yīng)過渡態(tài)的形成而發(fā)揮催化作用。

三、基因工程抗體的表達(dá)(一)在哺乳動物細(xì)胞（CHO）中的表達(dá)

(二)在微生物(原核)細(xì)胞中的表達(dá)

(三)在植物中表達(dá)（四）在酵母中表達(dá)

四、導(dǎo)向藥物導(dǎo)向藥物是由單抗與放射性核素(診斷用)、毒素或化學(xué)藥物的偶合物，也可用破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的酶、細(xì)胞因子等連接，稱為生物導(dǎo)彈，可特異地導(dǎo)向靶細(xì)胞的特定位點(diǎn)，發(fā)揮特意診斷和治療作用。五、基因工程抗體的導(dǎo)向生物治療單克隆抗體作為診斷試劑，應(yīng)用已相當(dāng)普遍。但單抗作為生物導(dǎo)彈的治療劑，鼠源性單抗常會因過敏反應(yīng)而妖折，自基因工程抗體問世后，成為最有前景的發(fā)展領(lǐng)域。常用于溶栓、殺腫瘤、抗病毒感染、殺死耐藥菌的生物治療。甚至可用抗HIV的ScFv基因來阻止HIV復(fù)制等。隨著噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)的發(fā)展，抗體組合文庫技術(shù)的成熟和推廣應(yīng)用，單抗的生物導(dǎo)彈功效將會有效發(fā)揮，其臨床應(yīng)用前景較為廣闊，市場是巨大的，必將會產(chǎn)生巨大的社會和經(jīng)濟(jì)效益。RT-PCR制備cDNA設(shè)計(jì)VH/VL或L鏈/Fd鏈基因上、下游引物進(jìn)行RT-PCR抗體組合文庫技術(shù)將PCR產(chǎn)物VH/VL或