酵母雙雜交系統(tǒng)中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄激活的研究

酵母雙雜交系統(tǒng)中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄激活的研究

1分子身份證編碼基因隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展，各種生物技術(shù)的研究工具層出不窮。在這種條件下，建立了真空雙交系統(tǒng)。Field和Song首先提出酵母雙雜交系統(tǒng),這是一種直接于酵母細胞內(nèi)檢測蛋白質(zhì)之間互相作用的新方法,可有效地用來分離能與一種已知的靶蛋白相互作用的蛋白質(zhì)的編碼基因。該技術(shù)以其簡便、靈敏、高效以及能反映不同蛋白質(zhì)之間在活細胞內(nèi)的相互作用等特點得到廣泛應用。它們證明了任何可以互相配對的蛋白質(zhì)都可以通過結(jié)合將互相分開的BD和AD拉近,并從而形成一個轉(zhuǎn)錄激活復合物。在一個典型的酵母雙雜交系統(tǒng)中,通常包括2個融合蛋白,一個由已知的蛋白X與BD組成,另一個由未知蛋白Y與AD組成,前者通常被稱為誘餌(bait),而后者通常被稱為獵物(prey)。此外,還包括一個人工構(gòu)建的,具有BD結(jié)合位點以及報告基因(reportergene)的質(zhì)粒。如果誘餌和獵物能夠在宿主細胞內(nèi)同時表達,那么由于兩者的互相作用,BD和AD形成轉(zhuǎn)錄激活復合物,從而激活報告基因的表達。2轉(zhuǎn)錄活性成分酵母雙雜交系統(tǒng)最初是根據(jù)真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控的特點建立的。真核生長轉(zhuǎn)錄因子含有兩個相對獨立的功能區(qū)域(DNAbindingdomain)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain,AD)。DNA-BD能夠識別效應基因的上游激活序(UpstreamActivatingSequence,UAS),并與之結(jié)合。DNA-AD則是通過同轉(zhuǎn)機(TranscriptionMachinery)中的其他成分之間的結(jié)合作用,以啟動UAS下游的基因進行轉(zhuǎn)錄。BD和AD可以人為的分離,分離的DNA-BD和AD單獨分別作用,并不能激活轉(zhuǎn)錄反應,但當兩者在空間上較為接近時,則呈現(xiàn)完整的轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性,將DNA-BD序列與一已知的蛋白質(zhì)X(常成為誘餌)的基因結(jié)合,構(gòu)建出BD-X融合表達載體,將AD序列與擬研究的另蛋白Y-靶蛋白(prey)的基因結(jié)合,構(gòu)建出AD-Y表達載體。將這2個表達載體共轉(zhuǎn)化至酵母細胞內(nèi)表達,此種酵母菌株既含有特定報告基因,并且已是去掉相應轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因,因此本身無報告基因的轉(zhuǎn)錄活性。如果蛋白質(zhì)X和Y可以互相作用,則即導致BD和AD在空間上的接近,從而激活UAS下游啟動子調(diào)節(jié)的報告基因的表達,反之,BD與AD就不能結(jié)合,報告基因也不能被啟動表達(圖1)。3融合蛋白檢測的作用機制酵母雙雜交系統(tǒng)具有以下優(yōu)點:①敏感性。主要是由于系統(tǒng)能使融合蛋白過量表達。激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域形成轉(zhuǎn)錄起始復合物,之后又與啟動子結(jié)合,此三元復合體使融合蛋白各組分間結(jié)合更趨于穩(wěn)定。檢測結(jié)果是基因表達產(chǎn)物的積累效應,如酵母的表形,因而可檢測存在于蛋白之間微弱或暫時的互相作用。②真實性。檢測在活細胞內(nèi)進行,作用條件與作用力無需模擬,在一定程度上代表了細胞內(nèi)的真實情況。③簡潔性。融合蛋白互相作用后,減少了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。④廣泛性。酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織器官細胞類型和分化期的材料構(gòu)建cDNA文庫,能分析不同亞細胞部位和功能的蛋白質(zhì),適用于部分細胞質(zhì),細胞核及膜結(jié)合蛋白。4錄激活活性劑酵母雙雜交系統(tǒng)在研究蛋白-蛋白、蛋白-核酸間互相作用方面快速有效,有廣泛的應用,但也存在一些局限性。它有些弊端是不容忽視的,“假陽性”是酵母雙雜交的一個重要問題。由于某些蛋白質(zhì)本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能或在酵母內(nèi)表達時的轉(zhuǎn)錄激活作用,使prey-BD融合基因與bait-AD融合基因表達產(chǎn)物無需特異結(jié)合,就能啟動轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。另外有些蛋白質(zhì)表面有對其他蛋白質(zhì)的低親和力區(qū),容易形成蛋白體復合物,能夠引起報告基因的表達,使酵母表現(xiàn)出相應的表形,產(chǎn)生假陽性結(jié)果。所分析的可能互相作用的蛋白質(zhì)必須定位于核內(nèi),才能激活報告基因,但是很多蛋白質(zhì)的相互作用依賴翻譯后加工如二硫鍵等的形成等,而此過程要在細胞質(zhì)內(nèi)完成,這樣,有許多蛋白質(zhì)不適用此方法。某些誘餌蛋白質(zhì)或待篩選蛋白質(zhì)在酵母中大量表達時,可能對酵母產(chǎn)生一定的毒性作用,如使酵母體內(nèi)的信號傳導通路阻斷,干擾酵母中正?；虻谋磉_調(diào)控,抑制酵母細胞的分裂,甚至使酵母細胞在選擇性培養(yǎng)基上不能生長等,使得某些種類的蛋白質(zhì)不能在該系統(tǒng)中進行分析。5關(guān)于母親飼料系統(tǒng)的進一步發(fā)展和展望5.1酵母單雜交序列的制備基于酵母雙雜交系統(tǒng)提出單雜交系統(tǒng)提出單雜交系統(tǒng),用于研究DNA-蛋白質(zhì)間互相作用。不同之處僅在于它省略了雙雜交系統(tǒng)中bait-BD蛋白雜代之交體,代之以具有與之特異結(jié)合位點的DNA,可以利用DNA序列捕獲具有與之特異結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。通過對酵母細胞內(nèi)報告基因的表達狀況的分析,來鑒別DNA結(jié)合位點并發(fā)現(xiàn)潛在的結(jié)合蛋白基因,或?qū)NA結(jié)合位點進行分析。運用此技術(shù)能快速篩選到與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。酵母單雜交系統(tǒng)靈敏性高,可直接獲得與DNA特異結(jié)合蛋白質(zhì)的基因序列。與雙雜交類似,同樣也會出現(xiàn)假陽性問題,有待進一步完善。5.2分子傳導作用三雜交系統(tǒng)是SenGupta等發(fā)展起來的,與雙雜交系統(tǒng)相似,只是2個雜交蛋白需通過第三個分子介導。三雜交必須滿足:2個蛋白無直接作用,必須通過第三個成分才能激活轉(zhuǎn)錄,第三個分子具有2個蛋白的位點。許多細胞內(nèi)信號傳遞過程中,兩蛋白間互相作用涉及第三個分子。而這第三種分子可以是蛋白質(zhì),小分子多肽和核酸。因此,此方法的發(fā)明大大擴展了酵母雙雜交系統(tǒng)的應用范圍。5.3作用的因素酵母雙雜交系統(tǒng)創(chuàng)立的初衷是研究蛋白間互相作用,如果這種作用很重要,那么解離作用必然導致對生物的重大影響,而研究阻斷蛋白之間的相互作用的因素也就很重要。逆向雙雜交系統(tǒng)由Shih等創(chuàng)立,可作為酵母雙雜交系統(tǒng)較好的補充。與酵母雙雜交系統(tǒng)比較,突出的特點在于構(gòu)建一種反向篩選報告基因即蛋白間特異相互作用所激活的報告基因能阻礙轉(zhuǎn)化體的生長,從而發(fā)現(xiàn)蛋白間結(jié)合的解離因素。Shih等用該系統(tǒng)對阻斷環(huán)腺苷酸效應分子結(jié)合蛋白與輔助因子相互作用的誘變劑進行了研究。Vidal等據(jù)此發(fā)現(xiàn)了影響轉(zhuǎn)錄因子E2F1中與DP1相互作用的點突變。5.4成為選定的方法之一,即成為選定的方法從酵母雙雜交系統(tǒng)理