hplc法同時(shí)測(cè)定小半夏湯中6-姜酚、6-姜醇的方法研究

hplc法同時(shí)測(cè)定小半夏湯中6-姜酚、6-姜醇的方法研究

小半夏湯來自張仲景的《缺錢要領(lǐng)》。它僅由半夏、生姜兩種藥物組成，但有良好的止吐效果。因此，歷代醫(yī)家都稱贊它是“嘔吐之藥”。目前對(duì)其的研究主要集中在藥理藥效方面。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn),小半夏湯水溶性部位中含有多種具強(qiáng)烈生理活性的核苷類物質(zhì)。該方中,生姜雖為臣藥,但現(xiàn)代研究表明,其中所含的姜酚、姜醇類物質(zhì)為其止嘔主要活性物質(zhì)。因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)該方中6-姜酚和6-姜醇進(jìn)行了測(cè)定,為全面研究小半夏湯作進(jìn)一步的探索。1sartorisb211d型電子天平的表征Waters2690型高效液相色譜儀,996PDA檢測(cè)器,Millennium32色譜管理系統(tǒng);SartoriusBP211D型電子天平。甲醇為色譜純,水為亞沸蒸餾水(自制);6-姜酚、6-姜醇對(duì)照品為由本實(shí)驗(yàn)室分離純化制得的黃色油狀物,經(jīng)UV、IR、MS、NMR等結(jié)構(gòu)測(cè)定,并經(jīng)HPLC檢測(cè)為單一成分,質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到99%以上;小半夏湯由南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院提供。2方法和結(jié)果2.1色度條件的確定2.1.1最大吸收波長的確定采用紫外區(qū)全波長掃描的方法,對(duì)6-姜酚和6-姜醇的最大吸收波長進(jìn)行研究,結(jié)果見圖1。發(fā)現(xiàn)兩者均在280nm處呈現(xiàn)最大吸收,因此確定了在280nm進(jìn)行測(cè)定的方法。2.1.2檢測(cè)波長和測(cè)量流量mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇-水(65∶35);檢測(cè)波長:280nm;柱溫:30℃;體積流量:0.8mL/min。理論塔板數(shù)以6-姜酚計(jì)不低于4000,并且6-姜酚、6-姜醇與其他組分的分離度均大于1.5。2.2溶液的制備2.2.1對(duì)照品貯備液的配制分別取減壓干燥至恒重的6-姜酚、6-姜醇對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇溶解,分別配成含6-姜酚6.365mg/mL、6-姜醇2.22mg/mL的對(duì)照品貯備液。2.2.2乙醇萃取法精密吸取裝量差異項(xiàng)下的本品約40mL,置150mL分液漏斗中,加入等量無水乙醚,萃取兩次,取乙醚層,蒸干,殘?jiān)眉状既芙?定量轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中,定容,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。2.3溶液中峰面積的測(cè)定分別精密吸取含6-姜酚6.365mg/mL、6-姜醇2.22mg/mL的對(duì)照品貯備液各0.2、0.6、1.0、1.4、1.8mL置10mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,制得系列混合對(duì)照品溶液。取10μL進(jìn)樣,測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣質(zhì)量對(duì)峰面積值作圖,回歸分析,結(jié)果6-姜酚在1.273~11.457μg有良好的線性關(guān)系,回歸方程為Y=6.207×105X-1.998×104,r=0.9999;6-姜醇在0.444~3.996μg有良好的線性關(guān)系,回歸方程為Y=3.273×105X-2.278×104,r=0.9998。2.4樣品、對(duì)照品色譜條件考察按處方比例制得缺生姜的陰性樣品,按供試品溶液的制備項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。按上述色譜條件分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液進(jìn)樣,記錄色譜圖,見圖2。結(jié)果在與對(duì)照品色譜相對(duì)應(yīng)處未出現(xiàn)色譜峰。表明按本實(shí)驗(yàn)條件,處方中的其他成分不干擾6-姜酚、6-姜醇的測(cè)定。2.5峰面積積分值的測(cè)定取供試品溶液(批號(hào)20071016)1份,重復(fù)進(jìn)樣6次,進(jìn)樣量10μL,記錄所測(cè)各組分峰面積積分值,計(jì)算,結(jié)果6-姜酚、6-姜醇峰面積積分值的RSD分別為1.54%、1.43%。2.6-姜酚和6-姜醇質(zhì)量濃度的測(cè)定取同一批樣品(批號(hào)20071016)6份,制備供試品溶液,依法測(cè)定,計(jì)算各組分的質(zhì)量濃度,結(jié)果6-姜酚、6-姜醇質(zhì)量濃度的RSD分別為0.43%、1.48%。2.7進(jìn)樣穩(wěn)定性試驗(yàn)吸取新配制的供試品溶液(批號(hào)20071016)1份,分別于0、2、4、6、8、10、12h進(jìn)樣,測(cè)定6-姜酚、6-姜醇的峰面積,結(jié)果其RSD分別為1.56%、1.41%,表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。2.8加樣回收率試驗(yàn)分別精密吸取裝量差異項(xiàng)下的批號(hào)20071016本品約20mL,平行5份,精密加入含6-姜酚1.498mg/mL,6-姜醇498μg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液5.0mL,制備供試品溶液,按上述色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定,計(jì)算回收率,結(jié)果6-姜酚的平均回收率為99.82%,RSD為1.40%;6-姜醇的平均回收率為100.30%,RSD為1.44%。2.9樣品測(cè)定取不同批號(hào)的小半夏湯制備供試品溶液。分別取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10μL進(jìn)樣測(cè)定,以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算質(zhì)量濃度,結(jié)果見表1。3萃取溶劑的選擇由于6-姜酚、6-姜醇在水中的溶解度很小,而在醚中和醇中的溶解度較大。因此在制備供試品溶液時(shí),試驗(yàn)采用乙醚作為萃取溶劑。萃取過程中發(fā)現(xiàn),用等