植物寄生線蟲防治研究進展

植物寄生線蟲防治研究進展

植物寄生蟲是一種廣泛分布于世界的植物致病性。它的寄生蟲種類繁多，環(huán)境適應性強，幾乎不會影響各種作物。大多數(shù)植物寄生線蟲侵染植物的根或其它地下部分,干擾植物水分和營養(yǎng)物質的吸收,造成直接危害;一些線蟲還能傳播植物病毒,破壞寄主植物對其它病原物如真菌、細菌的抗性。隨著現(xiàn)代農業(yè)的規(guī)?；l(fā)展,植物寄生線蟲造成的經濟損失逐年上升,短短十幾年已由770億美元增至1250億美元。我國地處溫帶和亞熱帶,氣候適宜于線蟲的活動和繁殖,世界性重要植物線蟲病害在我國均有發(fā)生,其中以根結線蟲和胞囊線蟲引起的危害最為嚴重。目前,大豆胞囊線蟲在我國的發(fā)生面積常年在135萬hm2以上;根結線蟲在保護地蔬菜生產中造成的損失嚴重時可達70%,甚至絕產;山東發(fā)生花生根結線蟲已有40多年歷史,對花生產量影響極大。因此,植物寄生線蟲的嚴重危害已成為制約我國農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的突出問題。防治線蟲的傳統(tǒng)方法包括輪作、殺線蟲藥劑、生物防治和抗線蟲品種培育等,由于作物輪作不適于防治寄主范圍較廣的根結線蟲,殺線蟲藥劑的大量使用其費用昂貴并且嚴重污染環(huán)境,生物防治見效緩慢,最為經濟有效的途徑是培育與利用抗線蟲新品種。常規(guī)的抗病育種目前存在兩方面問題:一是利用單一抗性基因使得不受抗性影響的線蟲大量繁殖而發(fā)展成為新病害,或造成線蟲小種變異;另一方面抗原材料來源匱乏也使常規(guī)育種遠遠不能滿足生產需要。因此,迫切需要探索新的抗線蟲育種途徑。近20年來,隨著植物與寄生線蟲之間相互作用機制研究的逐步深入,抗線蟲基因的分子遺傳操作技術已趨向成熟,為利用基因工程方法防治線蟲提供了許多新的策略。本文通過國內外近10年有關抗線蟲分子育種途徑的研究及進展,從抗線蟲基因、外源蛋白、特異表達啟動子及RNAi4個方面概述了植物抗線蟲基因工程的研究進展,展望了其在植物抗線蟲育種中的應用前景。1抗胞囊線蟲基因利用基因工程技術改良作物,加速育種工作進程,提高植物對線蟲的抗性,關鍵是克隆抗線蟲基因。目前已從多種植物中克隆或標記了一些抗線蟲基因(表1)。1997年Cai等從抗甜菜胞囊線蟲(Heteroderaschachtii)的野生甜菜(Betaprocumbens)中克隆了第一個植物抗線蟲基因HsIpro-1。此基因在植物根部特異表達,編碼一個由282個氨基酸組成的酸性蛋白質。還有幾個富含亮氨酸區(qū)域(leucine-richrepeat,LRR)構成的受體結構域和一個典型的跨膜區(qū)域,可能是定位于膜上的糖蛋白受體。這些結構特征與從番茄中分離的抗葉霉病基因Cf-9、Cf-2和Cf-4具有很大的相似性。這一基因已通過種間雜交和定位克隆技術轉移到栽培的甜菜中,并在CaMV35S啟動子的控制下得到表達,首次證明可用抗性基因培育抗性作物。另一個抗線蟲基因是從小麥中分離的抗胞囊線蟲基因Cre3,此基因編碼一個含有核苷酸結合位點(nucleotide-bindingsite,NBS)和一個富含亮氨酸區(qū)域的多肽,是小麥根部特異表達的基因,與擬南芥的Rps2、Rpm1和Rpp5基因,番茄的Prf和Ⅰ2基因,亞麻L6和M基因,煙草的N基因以及水稻的Xa1基因具有共同的結構特征。隨后從馬鈴薯中分離出抗胞囊線蟲基因Gpa2,Gpa2屬于LZ-NBS-LRR抗病基因家族成員,與抗病基因Rx1高度同源,然而它們具有不同的病原抗性,表明在分子進化過程中這些具有不同抗性的基因有可能來自于同一祖先。目前一類最重要的抗線蟲基因是Mi基因,抗3種主要的根結線蟲即南方根結線蟲(Meloidogyneincognita)、爪哇根結線蟲(M.javanica)和花生根結線蟲(M.arenaria)。Mi基因是通過種間雜交胚胎挽救法從野生種(Lycoperisiconperuvianum)導入栽培番茄種(Lycoperisiconesculentum)中的。Mi基因定位于番茄6號染色體上,具有NBS/LRR結構,編碼含有1257個氨基酸的蛋白。目前在番茄中國際上發(fā)現(xiàn)了9個Mi類抗根結線蟲基因,原來的Mi抗性位點表示為Mi-1,新發(fā)現(xiàn)的抗性基因分別稱作為Mi-2～Mi-9。研究發(fā)現(xiàn)Mi基因具有廣譜抗性——不但抗根結線蟲,還抗馬鈴薯蚜蟲(Macrosiphumeuphorbiae)和煙粉虱(Bemisiatabaci),是唯一具有同時抗3種不同生物的基因。Hero基因是另一個從番茄中分離得到的抗線蟲基因,對馬鈴薯胞囊線蟲具有廣譜抗性,對馬鈴薯金線蟲的抗性達到95%,對馬鈴薯白胞囊線蟲的抗性達到80%以上。在辣椒屬植物中第一個發(fā)現(xiàn)的抗線蟲基因是N基因,為單顯性基因,抗南方根結線蟲、爪哇根結線蟲、花生根結線蟲。存在于辣椒屬植物中最重要的抗線蟲基因是Me類基因家族。這些基因的來源、抗性譜范圍、抗病機制、對溫度的穩(wěn)定性各有不同,通過雙單倍體群體,在PMZ17和PM687共發(fā)現(xiàn)了5個抗病顯性基因(Me1-5),其中以Me1、Me3抗性譜較廣,抗3種主要的根結線蟲M.incognita、M.javanica、M.arenaria,而Me2、Me4、Me5分別控制了一種主要的根結線蟲的抗性,或是僅僅抵抗一種線蟲的某些株系。近年來,國內外學者圍繞大豆對胞囊線蟲的抗性問題展開了大量研究。對不同生理小種的線蟲,調控的基因不同,例如1號生理小種的抗病性由3對獨立的隱性基因控制,3號生理小種的抗病性至少需要3對獨立的隱性和1對顯性基因控制,非等位基因之間存在互作等。到目前為止,已經命名的基因有rhg1、rhg2、rhg3、Rhg4和rhg5。研究發(fā)現(xiàn),對任一小種沒有單一位點能夠提供完整抗性,每一小種的抗性一般有2～6個位點控制,不同的小種之間在抗性位點上具有一些共性,盡管不同的小種有不同的位點控制,但其中有一些位點對每一小種的抗性都是必需的。目前比較公認的是rhg1與Rhg4位點,已分別被定位到連鎖群G與A2上,并且分離到了緊密連鎖的分子標記。Zhang等在棉花上接種根結線蟲后,發(fā)現(xiàn)了一種抗線蟲基因MIC-3,它編碼14kDa的蛋白。在果樹、生菜、鷹嘴豆、煙草中也分別發(fā)現(xiàn)了抗根結線蟲的基因?？咕€蟲基因廣泛存在于各類植物中,需要進一步挖掘與開發(fā)利用。2外源蛋白及激素外源蛋白介導的植物抗線蟲基因工程的策略就是利用植物自身防御體系中的抗病相關基因,或抑制線蟲生長或對線蟲具有毒性的外源蛋白基因轉化感病植物,從而獲得對線蟲的抗性。目前常用的或具有應用前景的外源蛋白主要分為3類,一類是與植物自身防御體系相關蛋白,如誘導植物獲得系統(tǒng)性抗性(systemicacquiredresistance,SAR)反應的化學誘導物、幾丁質酶或膠原蛋白、外源凝集素等;另一類是對線蟲具有毒性的外源蛋白,如細菌毒素、蛋白酶抑制劑等;還有一類為線蟲分泌物特異抗體。獲得系統(tǒng)性抗性的化學誘導物,如β-氨基丁酸(BABA)對線蟲病害的誘抗效果突出。Oka等研究發(fā)現(xiàn)β-氨基丁酸可高效誘導番茄對爪哇根結線蟲的抗性,隨后,Oka等又研究了β-氨基丁酸對小麥線蟲的誘導抗病性,結果證實BABA對小麥根結線蟲病和胞囊線蟲病都有明顯誘抗作用。各種化學誘導物,以及SAR信號傳導途徑的中間產物是誘導SAR反應并最終賦予植物抗性的有效物質,在抗線蟲策略中具有很好的應用前景。幾丁質酶是植物防御體系中的重要病程相關蛋白,且具有抗真菌的作用。幾丁質酶的分解產物在線蟲生長和發(fā)育中起重要作用,通過幾丁質酶的分解來破壞線蟲的結構成分是植物抗線蟲基因工程的另一目標。據報道,將幾丁質酶作為外源蛋白在感病植物中表達,可以增強對線蟲的抗性作用。膠原蛋白是構成線蟲體表和消化道表面角質膜的一種主要結構蛋白。線蟲蛻皮過程中產生膠原酶以降解舊的角質膜。而植物本身不含膠原蛋白。因此,在轉基因植物中表達膠原酶基因,將破壞線蟲角質膜的完整性,干擾其正常的蛻皮方式,從而達到抗線蟲的目的。外源凝集素能專一性地使細胞表面的抗原糖蛋白連接,這些糖結合蛋白可作為靶標與線蟲在不同部位相互作用,如腸道、體表或化感器等。茄科植物凝集素可作為寄主植物與病原菌非親和性識別的植物識別子,增強植物抗病防衛(wèi)反應功能。編碼雪花蓮(Galanthusnivali)的凝集素GNA基因已經導入馬鈴薯中并得到表達。當表達量達根部總蛋白的0.5%時,可使馬鈴薯白胞囊線蟲(Globoderapallida)的雌蟲減少80%,相反,更高的GNA表達量卻使雌蟲數(shù)量增加,這表明僅有某一水平的GNA量對線蟲產生效應。選用外源凝集素作為抗線蟲外源蛋白應避免對哺乳動物、鳥類也具有毒性的外源凝集素。Geoghegan等發(fā)現(xiàn)了一種結合甘露糖和其它糖類的外源凝集素,能有效控制線蟲,并對哺乳動物和鳥類無毒性。細菌毒素,如蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis,Bt)毒素,可以引起害蟲消化道麻痹而致死。蘇云金桿菌在生長代謝過程中,可產生多種對害蟲有毒殺作用的毒素,其中β-外毒素和δ-內毒素對線蟲具有活性。δ-內毒素是由cry基因編碼,對線蟲有活性的cry基因有cry5、cry6、cry12、cry13和cry14。Criffitts等報道Bt外毒素對線蟲具有致死作用,將該毒素基因導入感病植株可以防御線蟲對感病植株的危害。線蟲取食是一種重要的生命活動過程,利用蛋白酶抑制劑干擾線蟲的取食和消化是目前研究較多的抗線蟲策略。常用的蛋白酶抑制劑有絲氨酸蛋白酶抑制劑、豇豆胰蛋白酶抑制劑、巰基蛋白酶抑制劑和金屬蛋白酶抑制劑等。Atkinson等首次證明,組成型表達豇豆胰蛋白酶抑制劑(cowpeatrypsininhibitor,CpTI)的轉基因馬鈴薯能夠減低胞囊線蟲的繁殖率或改變根結線蟲的性別比例,向有利于產生雄蟲的方向發(fā)展。另外,體外實驗表明水稻中巰基蛋白酶抑制的野生型(OC-1)和突變型(OCI△D86)能夠顯著抑制取食細菌線蟲的生長,隨后在番茄毛細根中表達這2個基因顯著地抑制了胞囊線蟲在植物中的發(fā)育,1997年Urwin等獲得轉OCI△D86的轉基因擬南芥和轉OCI△D86與CpTI的雙價轉基因擬南芥,研究證明轉基因擬南芥具有明顯的抗線蟲活性,而且含雙價基因的擬南芥抗線蟲能力更強。Atkinson等獲得的轉OCI△D86基因馬鈴薯、番茄等植株,經田間測試對根結線蟲和胞囊線蟲均具有較好的抗性。在線蟲侵入植物并形成取食結構的過程中,線蟲通過口針分泌大量分泌物,因此利用植物抗體或抗體片段來結合并封閉線蟲的分泌物可達到抗線蟲的目的。許多外源蛋白是結合線蟲分泌物的抗體。根結線蟲的唾液分泌物在線蟲傳染過程中具有重要作用,該分泌物對于線蟲在植物中的寄生位點與取食細胞的維持是必需的。一些與線蟲中編碼腺體分泌蛋白相關的基因已被分離。Rosso報道從雜交瘤細胞系獲得這些唾液分泌物的單克隆抗體IgM,并構建編碼抗原結合單鏈Fv蛋白(scFv)的人工合成基因,該基因通過PCR擴增反應從編碼來自IgM抗體的不同區(qū)域產生。該抗體表現(xiàn)出對線蟲唾液提取物的特異結合性,并已在原生質體穩(wěn)定表達。線蟲的卵寄生真菌可以產生破壞線蟲卵的蛋白酶,如由真菌(VerticilliumchlamydosporiumGoddard)分泌的枯草桿菌蛋白酶,克隆這些蛋白的基因并用于轉基因植物的研究,也能達到特異的抗線蟲的目的。3降低基氧化酶抑制劑在食物體內的表達棲居型內寄生線蟲侵入植物后形成特定的取食位點結構(nematodefeedingsitestructure),取食位點的形成是寄生線蟲和寄主植物之間相互作用的結果。線蟲改變了寄主植物中取食位點細胞的基因表達方式,使得大部分細胞表達基因關閉,一少部分受線蟲誘導的基因得以表達。利用基因工程技術可鑒定出僅在線蟲侵染后才在取食細胞中表達的基因啟動子,即受線蟲誘導表達啟動子,在該啟動子的下游導入受該啟動子控制的細胞致死基因,它的表達將導致寄生線蟲所依賴的植物特異細胞即取食細胞的死亡。顯然,該策略的實現(xiàn)首先是對取食位點特異啟動子的識別。理想的啟動子是取食位點特異誘導啟動子,它只在寄主細胞附近表達而在健康植物組織中不表達。近10年來,一些根特異啟動子已被分離鑒定,如從擬南芥分離的根特異表達β-微管蛋白基因的啟功子TUB-1、絲氨酸/蘇氨酸激酶基因的啟功子ARSK1、核糖體蛋白L16基因的啟功子RPL16A。Atkinson及合作者比較了這3個根特異啟動子對巰基蛋白酶抑制劑基因(OCI△D86)在馬鈴薯根部特異表達的抗線蟲活性,發(fā)現(xiàn)3個啟動子均調節(jié)巰基蛋白酶抑制劑基因在根部高效表達,轉ARSK1-OCI△D86基因植株對胞囊線蟲的田間抗性達到(70±4)%,轉TUB-1-OCI△D86基因植株對根結線蟲的田間抗性達到(67±9)%,均高于轉CaMV25S啟動子。因此,TUB-1和ARSK1是構建根特異高效表達的基因工程元件,在植物抗線蟲基因工程中具有重要的應用價值。4采用基因功能進行植物寄生蟲的研究植物抗線蟲基因工程發(fā)展迅速,但是真正商品化的轉基因植株還很少,主要是因為無論抗線蟲基因還是蛋白酶抑制基因,其表達產物均為蛋白質,超表達的轉基因可能存在潛在的生物安全問題,而特異啟動子下游結構基因的表達可能對與取食位點毗鄰的細胞的生存構成威脅,因此,探索基于植物寄生線蟲生長發(fā)育相關基因的功能喪失,利用反義遺傳學途徑構建抗線蟲基因,已成為最具活力的研究領域之一。RNAi(RNAinterference)是由雙鏈RNA引發(fā)的轉錄或轉錄后基因沉默機制(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)。長dsRNA被核酸酶降解成21～23bp大小的片段,與具有序列同源性的mRNA結合并使之降解,從而抑制基因的表達。Fire等從注射雙鏈RNA(dsRNA)秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)腸道導致同源靶標基因RNA沉默現(xiàn)象,首次正式證明線蟲存在RNAi現(xiàn)象。隨后,相繼在植物、真菌、錐蟲、渦蟲、果蠅、水螅、小鼠和哺乳動物細胞中都發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象。由于RNAi具有高特異性、高穿透性、高效及高穩(wěn)定性,因此已被用作大規(guī)模分析基因功能的試驗手段,并為植物病害防治提供了新的思路和方法。近年來,通過dsRNA溶液直接浸泡線蟲或線蟲喂飼表達dsRNA的工程細菌或注射釋放dsRNA鑒定了秀麗隱桿線蟲(C.elegans)染色體I的90%和染色體III的96%預測基因,其中86%具有RNAi功能抑制作用。實驗證明,RNAi表型至少可持續(xù)兩代,這一特點為轉基因控制植物寄生線蟲奠定了基礎。Atkinson及合作者在植物寄生線蟲RNAi方面開展了開創(chuàng)性研究,Urwin等利用章魚胺具有刺激口針型植物線蟲吞食溶液進入腸道的功能,將J2胞囊線蟲(大豆胞囊線蟲H.glycines、馬鈴薯胞囊線蟲G.pallida)浸泡在2～5μg/μL靶標基因正義與反義RNA形成的dsRNA、50mmol/L章魚胺溶液中,證明章魚胺刺激浸泡使半胱氨酸蛋白酶、hgctl(大豆胞囊線蟲一個未知功能基因)、精子主蛋白(MSP)3個基因的dsRNA可釋放到J2腸道,并且RNAi誘變胞囊線蟲接種寄主植物14d再分離,發(fā)現(xiàn)3個靶標基因的表達明顯受到抑制,相應的表觀遺傳性狀也發(fā)生改變。Bakhetia試驗表明,南方根結線蟲中90%～95%的個體吸收了編碼一過氧化酶的dsRNA,14d后雌蟲的數(shù)量和大小受到明顯抑制,產卵量減少了70%以上。另外,Elena等成功地利用RNAi技術抑制了線蟲幾丁質酶的生成。隨后,Rosso等研究發(fā)現(xiàn),簡苯二酚可刺激南方根結線蟲對dsRNA的吸收,并且觀察到了明顯的RNAi現(xiàn)象,而在取食含有章魚胺的dsRNA中,未觀察到RNAi現(xiàn)象。此試驗通過對編碼食道腺蛋白的Mi-crt和Mi-pg-1進行干擾,發(fā)現(xiàn)92%的個體基因沉默。Chen等利用RNAi分析了馬鈴薯金線蟲的β-1,4內切葡聚糖酶的功能,并證明gr-ams-1基因是在寄主中定位的關鍵基因。還有一種利用RNAi技術敲除感病基因(如線蟲取食位形成相關基因)的策略。即缺失感病基因,達到阻止病源侵入的目的。這種防治策略已有成功例子,例如在擬南芥中缺失pmr6基因,可抑制真菌的侵入。棲居型內寄生線蟲侵入植物后形成特定的取食結構,從寄主植物中吸取營養(yǎng)物質,以供其生長發(fā)育所需。一旦營養(yǎng)物質供應不足將降低線蟲的繁殖率或抑制雌蟲的形成,甚至導致線蟲的死亡。所以分離與線蟲取食位點相關的基因,并抑制此類基因的表達,可達到抗線蟲的目的。最早的范例是突變rpe基因,證明rpe是巨細胞早期形成的必要基因。隨后研究表明,AtFH6基因編碼的膜錨定蛋白參與在取食位點形成中肌蛋白細胞骨架的形成。缺失這類寄主基因,可以達到阻止線蟲入侵的目的。所以,利用RNAi技術敲除感病基因抑制線蟲的侵染,具有廣闊的應用前景。目前國際上已經對秀麗隱桿線蟲(C.elegans)的全基因組序列進行了測定,這將為植物抗線蟲基因工程研究提供非常有力的支持。2004年“N”上發(fā)布了10種植物寄生線蟲79699個EST序列。2004年,Gunsalus等建立了秀