膠體金的制備

膠體金的制備膠體金的制備根據(jù)不同的制備方法，可以制備出直徑1－500nm的膠體金粒子，但做為免疫標(biāo)記探針，其直徑應(yīng)在3-30nm范圍內(nèi)。在氯化金（HAuCI4）水溶液中加入還原劑使之還原并聚積形成膠體金粒子。使用不同種類、不同劑量的還原劑，可以控制所產(chǎn)生的粒子大小。即粒子大小取決于反應(yīng)溶液中最初還原試劑和還原核的數(shù)量。還原劑濃度越高，核濃度也越高，氯化金的還原也就從更多的還原中心開始，因此產(chǎn)生的膠體金粒子數(shù)量越多，但體積也越小。粒子直徑每增加一倍，數(shù)量減少為原來的1/8。以檸檬酸鈉和單寧酸做還原劑，能夠制備大小相對(duì)一致、直徑3?16nm的膠體金。因此一般膠體金探針均使用該方法進(jìn)行。但該方法制備的膠體金粒子直徑范圍較窄，而且殘留的多聚單寧酸殘基往往干擾某些蛋白與金粒子的結(jié)合。此時(shí)在溶液中添加0.1?0.2%的H2O2能夠去除這些殘基。雙標(biāo)記或制備5-10nm的膠體金時(shí)建議使用該方法。禾I」用檸檬酸為還原劑，可以制備12?150nm直徑的膠體金。但制備大體積的膠體金時(shí)，膠體金粒子的誤差也同時(shí)增加。因此做單標(biāo)記時(shí)，建議使用該方法制備12-16nm直徑的膠體金。除了上述方法外，也可以用磷作為還原劑來制備5nm的膠體金，它避免了單寧酸殘基的問題，但所形成的金粒子體積變化較大。磷易燃且有毒，制備的殘液需進(jìn)一步處理，故該方法已經(jīng)很少使用。氯化金極易吸濕，故一般均以小劑量密封保存（0.5g或1g）,因此在配制氯化金溶液時(shí)一次配完，暫時(shí)不用的可以用1.5mI試管分裝為1ml保存（-20弋）。注意各種玻璃器皿一定要洗凈并用雙蒸水多次沖洗，有條件時(shí)可硅化處理（1%雙氯硅烷/氯仿浸泡1小時(shí)，烘干）。配制各種試劑時(shí)均使用雙蒸水，隨后再用0.22um微孔濾膜過濾后使用。三角瓶可反復(fù)多次使用，不用時(shí)應(yīng)密封保存，以防污染。制備好的膠體金保存壽命較長(zhǎng)，可4弋保存6個(gè)月以上或室溫下保存1-2個(gè)月。當(dāng)出現(xiàn)明顯懸浮物或沉淀后表示已不可再用。但無論無何，在保存較長(zhǎng)時(shí)間后應(yīng)進(jìn)行鏡檢，如出現(xiàn)大量膠體金粒子凝集，說明已經(jīng)過期。1單寧酸/檸檬酸鈉法制備3?16nm膠體金取-250ml三角瓶，加入79ml雙蒸水和1ml1%氯化金，預(yù)熱至60?70°C。取-50ml燒杯，加入4ml1%檸檬酸鈉，然后根據(jù)所制備金粒子體積大小加入不同用量的單寧酸及等量的25mMK2CO3。預(yù)熱至60?70C。K2CO3的作用是保持溶液的中性pH。因此如果單寧酸的量少于0.5ml時(shí)，對(duì)pH的影響不大，K2CO3可以省略。將上兩種溶液迅速混合并充分混勻，加熱至沸并保溫10分鐘自然冷卻。檸檬酸鈉(ml)單寧酸(ul)膠體金(nm)450003420004450064120847010410162、 白磷還原法制備5nm膠體金取250ml三角瓶-個(gè)，加79ml雙蒸水，1ml1%氯化金，并用0.25MK2CO3將溶液調(diào)至中性(pH7.0)。取0.2ml飽和$磷/乙醚溶液加到1.5ml試管中，再加0.8ml乙醚，混勻。取0.7ml加入溶液(1)中(磷有毒且易燃，操作請(qǐng)帶手套，多余的磷溶液用CuSO4進(jìn)行中和)。室溫下輕輕搖勻15min,然后加熱沸騰并保持5min,自然冷卻。3、 檸檬酸三鈉法制備12-30nm膠體金(Frens,1973)取250ml三角瓶一個(gè)，加100ml雙蒸水及1ml1%氯化金，加熱沸騰；（2） 取不同量的1%檸檬酸鈉加入上述溶液中?；靹?，再保持沸騰30min，溶液顏色首先變黑，再逐漸變紅，粒子體積較小時(shí)，溶液呈桔紅色，而粒子體積較大時(shí)，則顏色偏向紫色。注意：（1） 由于使用試劑質(zhì)量及其它方面可能存在的誤差，以及制備過程中的其它問題，膠體金粒子的大小及一致性與理論值可能有偏差，因此，在制備完成后必須進(jìn)行鏡檢。如出現(xiàn)粒子體積偏差太大，粒子凝聚，粒子邊緣不清晰等問題，須重新制備。（2）膠體金溶液最好保存在4弋冰箱中；也可保存在室溫下，一般可保存1-2個(gè)月。但決不可保存在0°C以下，否則金粒子發(fā)生凝聚。二、蛋白-金復(fù)合體的制備—般認(rèn)為膠體金粒子表面為一層AuCI2，因此，粒子表面帶有負(fù)電荷，這種負(fù)電荷粒子之間相互排斥，形成穩(wěn)定懸浮的膠體金溶液。金顆粒表面可以包被一層生物大分子（如蛋白）來穩(wěn)定和保護(hù)這些粒子，以免受外來電解質(zhì)的影響而相互凝聚在一起。膠體金粒子對(duì)蛋白的吸附作用取決于pH值，這是因蛋白的凈電荷取決于溶液的pH值，在pH=pI時(shí)為中性。由于在pH=pI時(shí)蛋白溶解度最小，因此這時(shí)它水化程度最小，最溶液吸附到疏水的金粒子表面。但在實(shí)際的膠體金探針制備中，一般膠體金調(diào)整為pH二PI+0.5，這樣蛋白帶正電，有利于結(jié)合更穩(wěn)定。膠體金探針?biāo)玫鞍妆仨氁?jīng)過前處理，其目的在于（1）去除高濃度的鹽分，高濃度的鹽分往往干擾蛋白與膠體金的吸附結(jié)合，或?qū)е履z體金粒子的凝聚，這一步往往采用低濃度緩沖液中進(jìn)行。（2）使蛋白分子盡量分散為單體，凍干蛋白或高濃度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚為多聚體大分子，可同時(shí)與多個(gè)膠體金粒子結(jié)合，影響標(biāo)記的靈敏度和定量分析。（3）使蛋白具有適當(dāng)?shù)姆肿恿?。蛋白分子量過小（30kD）,形成的蛋白復(fù)合體往往是不穩(wěn)定，可短時(shí)間內(nèi)失活。而分子量過大時(shí)，被認(rèn)為影響探針的靈敏度，特別是已知蛋白的結(jié)構(gòu)與活性中心的情況下，去除對(duì)活性武影響的結(jié)構(gòu)部分是提高標(biāo)記靈敏度，延長(zhǎng)探針壽命（防止凝集）的有效辦法。把分子量過小的蛋白與其它蛋白(如BSA，牛血清蛋白等)結(jié)合后，能制備出穩(wěn)定性更佳的探針。當(dāng)?shù)鞍浊疤幚硗瓿珊?，接著要確定膠體金與蛋白結(jié)合的最佳pH值。對(duì)于理化性質(zhì)不確定的蛋白這一步尤為重要。過量的蛋白與不同pH值得膠體金結(jié)合后，只有某一特定pH值能夠形成結(jié)合最穩(wěn)定的探針。在高濃度電解質(zhì)(如NaCI)作用下不會(huì)凝聚。不同蛋白的適宜pH范圍的寬窄大不相同。一般選擇最小適宜pH值為最佳pH值。但有些探針的實(shí)際情況并不完全如此，最穩(wěn)定發(fā)探針并不完全代表活性最好。這要靠實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。在確定最佳pH值后，最后要確定最小蛋白量，即能夠形成穩(wěn)定探針的蛋白的最小量。如果在制備探針時(shí)加入太多的蛋白，不僅造成浪費(fèi)，而且更為嚴(yán)重的是容易造成探針凝聚，并嚴(yán)重影響標(biāo)記活性。因?yàn)樘结樔芤褐械挠坞x蛋白容易搶先與標(biāo)記位點(diǎn)結(jié)合，起到“封閉”(Blocking)作用，而膠體金探針標(biāo)記不上。在標(biāo)記位點(diǎn)希少、被標(biāo)記物含量較少的情況下要特別注意。這里需要特別指出的是，使用不同直徑的膠體金與同一蛋白結(jié)合時(shí)，除了蛋白量完全不同外，往往最佳pH也有一定變化。因此，在探針制備每一環(huán)節(jié)應(yīng)隨時(shí)監(jiān)測(cè)探針對(duì)分布情況、負(fù)染結(jié)合及活性。1、抗血清的前處理一般抗血清中IgG的含量為10-25%，而絕大部分為其它蛋白。用抗血清直接制備探針其標(biāo)記活性與特異性均不理想。因此需去除其中多數(shù)雜蛋白。但處理環(huán)節(jié)不宜太繁，在實(shí)驗(yàn)室設(shè)備與經(jīng)驗(yàn)缺乏的情況下更是如此，否則會(huì)導(dǎo)致IgG活性的大幅降低。如果你的實(shí)驗(yàn)室在蛋白純化方面有很強(qiáng)的技術(shù)支持，高度純化后效果會(huì)更好。大量工作表明，只用硫酸銨沉淀就可以得到足夠純度及高活性的IgG蛋白。其基本步驟如下：取抗血清0.2ml；加生理鹽水(0.85%NaCI)0.3ml，混勻;逐滴加入飽和(NH4)2SO40.5ml，充分振蕩混勻，4弋靜置1h;⑷10000rpm/min離心20min,棄上清；加0.5ml生理鹽水重懸浮，混勻；S04，充分振蕩混勻，4弋靜置1h；逐滴加0.25ml飽和(NH4)210000rpm/min離心20min,棄上清；重復(fù)5?8步驟一次；加生理鹽水0.5ml重懸浮，混勻；生理鹽水中透析12?24h；在0.2MpH9.0硼酸緩沖液透析12?24h；分裝，即將使用時(shí)4弋保存，備用-20弋保存。為最大限度保持抗體活性，整個(gè)過程應(yīng)在4弋下進(jìn)行。對(duì)于凍干抗血清或長(zhǎng)時(shí)間保存的血清，將生理鹽水透析改為3MKCNS透析，促使聚合的多聚體解聚。如果抗血清效價(jià)較低時(shí),不宜準(zhǔn)備膠體金探針。2、親和純化抗體的處理親和純化抗體多是一些商品化的通用抗體,即二抗。一般為羊抗兔、羊抗鼠或羊抗人的抗體。這些抗體一般有兩個(gè)問題,一是IgG分子往往聚集為多聚體分子,二是往往含有較多的鹽分。因此前處理的目的在于脫鹽和解聚。其基本步驟如下：將親和純化抗體用生理鹽水稀釋為0.5-1mg/ml濃度在3MKCNS(硫氰酸鉀)溶液中透析12h在2mMolpH9.0的硼酸緩沖液中透析12h(更換透析液數(shù)次)分裝備用其它蛋白可參考此方法進(jìn)行。但注意后一種透析液的pH值應(yīng)與交聯(lián)時(shí)pH值一致。在實(shí)際運(yùn)用中，一般省略去3MKCNS透析這一步，特別是當(dāng)?shù)鞍追肿恿枯^小,且為非糖蛋白時(shí)。我們建議在制備通用探針(如二抗IgG,ProteinA,ProteinG,Streptavidin)等時(shí)，嚴(yán)格使用該方法,而制備直接標(biāo)記探針時(shí),也可以忽略處理步驟。3、 IgGFab片段的制備一般來說體積較小的探針具有相對(duì)較高的標(biāo)記活性。主要原因在于膠體金顆粒較小時(shí)有利于在標(biāo)記溶液中的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)；在膠體金直徑一定時(shí)，蛋白分子量越小，金表面吸附的蛋白分子越多，活性位點(diǎn)也越密集，也容易于靶位點(diǎn)結(jié)合。IgG分子量為150kD左右，由4個(gè)亞基組成，即兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)。用水解酶(木瓜蛋白酶)水解后可得到兩種片段，即Fab和Fc。其中Fab是具有抗原識(shí)別活性的部分，回收后制備探針。Fc能夠與ProteinA和ProteinG特異性結(jié)合。但這種分離只能在有條件的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。其基本過程如下：⑴用PBS(pH7.0，含10mMEDTA,20mM鹽酸半胱氨酸)溶解純化的IgG加固化木瓜蛋白酶37°C處理5h離心，去除固化木瓜蛋白酶(沉淀)過ProteinG柱純化的Fab片段按前文方法做進(jìn)一步處理注：Fab與膠體金結(jié)合的pH值為6.54、 蛋白與膠體金結(jié)合最佳pH測(cè)定(例纖維素酶，pI未知)取若干個(gè)1.5ml試管，分別加入1ml10nm膠體金；用25mMK2CO3將pH分別調(diào)為3,4,5,6,7,8,9,10；取一96孔培養(yǎng)板，按pH從低到高分別將上述膠體金分別取100ul加入孔中，重復(fù)三次；uul濃度為1mg/ml的纖維素酶，混合，室溫下放置10-15min;u(4)每孔分別加入3ul濃度為10%NaCl溶液，混合，室溫下放置10min；u每孔分別加入20⑹觀察膠體金顏色變化，記錄保持紅色的最低pH(X);重復(fù)(1)-(5)步，pH梯度為X-0.6；X-0.3；X；X+0.3；X+0.6；X+1。觀察膠體金顏色變化直到室溫下放置2小時(shí)，記錄仍保持紅色的最低pH。注意：如膠體金粒子直徑較小(3?6nm),加NaCI需放置較長(zhǎng)時(shí)間(幾個(gè)甚至十幾個(gè)小時(shí))后才能觀察到顏色變化。必要時(shí)可放大反應(yīng)體積(1ml膠體金)，并借助離心來判斷。2.有些蛋白最佳pH范圍較窄，設(shè)置的梯度不能太大。5、 最小蛋白濃度的確定用0.22um微孔濾膜過濾或高速離心去除蛋白中殘物或多聚體；取一96孔滴定板，每個(gè)重復(fù)為若干個(gè)孔，分別加入最佳pH的膠體金100ul,重復(fù)3次；各孔依次加入不同量的蛋白(一般濃度為0.05-0.1mg/ml)1?20ul，混勻，室溫下放置15min;⑷加入20ul10%NaCI，室溫下放置10min;顏色仍保持紅色的最小蛋白用量即最小蛋白濃度。為確保結(jié)果準(zhǔn)確性,可放大反應(yīng)體積重復(fù)以上步驟。注：在實(shí)際探針制備工作中,蛋白濃度往往為最小濃度的130%。6、 IgG-gold的制備取兩個(gè)1.5ml試管，分別加入1.2ml10nm膠體金；加入適量25mMK2CO3把pH調(diào)整為9.0;分別加入10ul濃度為1mg/mlIgG,混勻，室溫放置10min;⑷分別加入12ul2%PEG20000，室溫放置5min;10000rpm離心20min，輕輕吸除上清；用20ulBL溶液重懸浮松散的膠體金沉淀，并集中到新管中；分別加20ul甘油，充分混勻；-20°C保存?zhèn)溆谩?不同直徑膠體金所需要的蛋白量差別很大；.不同直徑膠體金所需離心速度完全不同。以絕大部分探針形成松散沉淀為原則。離心力太大，會(huì)產(chǎn)生不可逆的探針凝聚；離心力太小，探針無法沉下。最好能夠直接用膠體金在不同轉(zhuǎn)速下離心以確定適當(dāng)?shù)碾x心力。.在冷離心機(jī)中可適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間，同時(shí)適當(dāng)減小離心力，探針活性較好。.IgG的最佳交聯(lián)pH有多種報(bào)導(dǎo)，從7.4-9.0o-般認(rèn)為，7.4時(shí)膠體金結(jié)合的蛋白最多，9.0時(shí)制備的探針最穩(wěn)定。三、樣品的固定、包埋與標(biāo)記1．固定C以下。？為了減少對(duì)標(biāo)記底物結(jié)構(gòu)的破壞，細(xì)胞化學(xué)樣品固定的時(shí)間相對(duì)較短，多為1-3小時(shí)。環(huán)境溫度一般在25-1,3-葡聚糖、幾丁質(zhì)等)，可用常規(guī)方法進(jìn)行4%戊二醛和1%鋨酸的雙固定低溫固定劑一般采用2-3%甲醛與1%戊二醛。甲醛分子量小、滲透快，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響小，可較好地保存其抗原活性。但對(duì)細(xì)胞整體的細(xì)微結(jié)構(gòu)保存欠佳。戊二醛對(duì)細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)保存較好，但往往導(dǎo)致蛋白失去抗原活性。因此，在標(biāo)記低物不是蛋白質(zhì)或多肽時(shí)(如纖維素、多酚類化合物、2．包埋根據(jù)標(biāo)記低物的不同，可以選擇常規(guī)(常溫)包埋劑或低溫包埋劑包埋樣品。如果標(biāo)記物為蛋白質(zhì)，特別是性質(zhì)不穩(wěn)定或不清楚時(shí)，建議使用低溫包埋劑包埋，以最大程度保存抗原活性。大量實(shí)驗(yàn)表明，K4M是目前使用最為普遍的低溫包埋劑。當(dāng)選擇常溫包埋劑時(shí)，建議使用Spurr包埋劑。Spurr包埋劑粘性小，易滲透，易操作；包埋塊不吸潮，保存時(shí)間長(zhǎng)。3．標(biāo)記根據(jù)標(biāo)記程序的不同，標(biāo)記分直接與間接標(biāo)記。直接標(biāo)記指膠體金探針直接與被標(biāo)記底物結(jié)合；而間接標(biāo)記指膠體金探針通過一或多個(gè)中間標(biāo)記物后與底物結(jié)合。直接標(biāo)記間接標(biāo)記直接標(biāo)記需要制備膠體金探針，其好處是標(biāo)記特異性好，背景小，能夠做陰性對(duì)照。間接標(biāo)記無需制備膠體金探針，可以直接購(gòu)買通用二抗探針，缺點(diǎn)是標(biāo)記特異性較難把握，背景較高，不能夠做陰性對(duì)照。在做病毒粒子標(biāo)記時(shí)，直接標(biāo)記法可用抗體直接富集低濃度或稀有病毒而不會(huì)增加任何背景。影響標(biāo)記的因素主要包括以下方面：（1）pHpH變化會(huì)對(duì)探針蛋白的結(jié)構(gòu)與活性中心產(chǎn)生影響，繼而影響到標(biāo)記強(qiáng)度與特異性。在很多情況下探針作用的最佳pH值往往與該蛋白作用的最佳pH值有一定差別。例如有一種來自真菌的纖維素酶本來在pH4.8時(shí)活性最強(qiáng)，但結(jié)合到膠體金上后，pH在6.0左右時(shí)最強(qiáng)，當(dāng)pH到7.2時(shí)仍有較強(qiáng)的標(biāo)記活性。（2）離子環(huán)境有些蛋白只有在一定離子環(huán)境中才有生物活性，其中很多涉及Ca2+，Mg2+，Mn2+，Cu2+等陽離子。有時(shí)溶液中Ca2+、Cu2+等容易形成不溶性沉淀而導(dǎo)致標(biāo)記失?。灰虼?，在配制標(biāo)記溶液時(shí)要注意各種陰陽離子的配伍，添加順序及溶液pH。（3）溫度標(biāo)記溫度對(duì)標(biāo)記活性及特異性影響最大，也最容易出問題。以水解酶類做成的膠體金探針對(duì)溫度變化也更為敏感，不同溫度、不同時(shí)間標(biāo)記出的切片其視覺效果完全不一樣。在此特別指出一點(diǎn)，在用內(nèi)切的水解酶探針時(shí)，切忌溫度過低，時(shí)間過長(zhǎng)，否則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)記的擴(kuò)散現(xiàn)象。建議在可能時(shí)盡量使用外切酶探針。在使用IgG或ProteinA,ProteinG探針時(shí)，有人認(rèn)為在4弋下長(zhǎng)時(shí)間標(biāo)記特異性最好。但我們研究發(fā)現(xiàn)事實(shí)并非如此，在25弋以上的室溫下標(biāo)記20-60min其特異性更好。一般來說，如果用來自植物或微生物的蛋白做探針，標(biāo)記溫度最好在25弋左右；用來自動(dòng)物的蛋白做探針時(shí)，標(biāo)記溫度最好在30弋左右。（4）封閉液組成封閉液對(duì)封閉有關(guān)非特異性活性基團(tuán)，特別是醛基至關(guān)重要。在多數(shù)情況下封閉液與探針重懸浮液、標(biāo)記溶液是一樣的。目前最常用的封閉液組分有BSA、卵清蛋白、脫脂奶粉、PEG20000等。在用IgG、ProteinA、ProteinG等標(biāo)記時(shí)，應(yīng)優(yōu)先選用BSA（組分五）；在植物凝集素類探針標(biāo)記時(shí)，應(yīng)優(yōu)先選用PEG20000。也有人發(fā)現(xiàn)IgG探針標(biāo)記時(shí)脫脂奶粉最佳。如果是用交聯(lián)蛋白做成的探針，那么封閉液中最好有載體蛋白的成分超過了判讀時(shí)間結(jié)果還準(zhǔn)確嗎？答:結(jié)果不準(zhǔn)確，應(yīng)按照說明書規(guī)定的時(shí)間判讀。如果到判讀時(shí)間為止，結(jié)果為陰性，判讀時(shí)間以后，出現(xiàn)淡淡的線條，可能是有色標(biāo)記物持續(xù)釋放造成的，但是這種結(jié)果是無效的。使用冰箱保存的標(biāo)本和產(chǎn)品，應(yīng)該注意什么？答：若標(biāo)本、試劑、緩沖液冷藏后，檢測(cè)前應(yīng)把冷藏過包裝完好的檢測(cè)試劑、緩沖液放置空氣中復(fù)溫，冷藏或冷凍的標(biāo)本檢測(cè)前也應(yīng)復(fù)溫。如果沒有與室溫平衡即開始檢測(cè)，空氣中的水分遇冷凝集在沒有復(fù)溫的試劑上，導(dǎo)致產(chǎn)品受潮，可能影響測(cè)試結(jié)果。如果冰箱濕度較高，不建議開封過的筒裝產(chǎn)品在冰箱內(nèi)保存。樣品移行速度特別慢或無樣本跑動(dòng)現(xiàn)象（在反應(yīng)窗內(nèi)不見有液體在膜上流動(dòng)）答：加入的標(biāo)本量或全血加稀釋液的量不夠：重新試驗(yàn)。包裝袋破損或試劑失效：重新試驗(yàn)。從冷環(huán)境取出后沒復(fù)溫：重新試驗(yàn)。診斷試劑裝配不當(dāng)：與供應(yīng)商聯(lián)系。在反應(yīng)窗內(nèi)見到紅色豎線答：當(dāng)樣本在膜上流動(dòng)時(shí)可能發(fā)生：該情況不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，但保證背景清晰的情況下在規(guī)定時(shí)間內(nèi)讀取結(jié)果。可能使用了已溶血樣本：用新鮮標(biāo)本重新測(cè)試。規(guī)定的結(jié)果讀取時(shí)間時(shí)未見C線？答：加入的樣本量不夠：重新測(cè)試，按說明書要求加入足夠的樣本量。加入的樣本量太多，導(dǎo)致產(chǎn)品流動(dòng)不正常：按照說明書要求滴加樣本量。樣本不流動(dòng)，試劑有問題：與供貨商聯(lián)系。用血清血漿試劑檢測(cè)全血：用對(duì)應(yīng)的標(biāo)本檢測(cè)。檢測(cè)后出現(xiàn)假陽性結(jié)果答:血清/血漿樣本中含有特殊干擾物質(zhì)：用另外的方法確診檢測(cè)結(jié)果。在超過規(guī)定時(shí)間后讀取結(jié)果：不要在說明書規(guī)定讀數(shù)時(shí)間后讀取檢測(cè)結(jié)果。檢測(cè)后出現(xiàn)假陰性結(jié)果答：樣本中被檢樣本濃度低于檢測(cè)閾值：用其它檢測(cè)方法確認(rèn)。該樣本含有的亞型較為特殊或者病毒變異能力強(qiáng)：用其它檢測(cè)方法確認(rèn)該患者是否為陽性。很淡的線條客戶判為陰性：仔細(xì)閱讀說明書，按照指定的判讀方法判斷。沒到規(guī)定的時(shí)間提前判定結(jié)果：仔細(xì)閱讀說明書，按照指定的判讀方法判斷。幽門螺桿菌igG抗體膠體金免疫層析快速診斷試紙條的研制作者：張寶元，王曉偉，崔小【摘要】目的建立一種快速檢測(cè)抗H.pyloriigG抗體的膠體金免疫層析試紙條，并優(yōu)化制備中各關(guān)鍵步驟的實(shí)驗(yàn)條件。方法以檸檬酸三鈉還原法制備20nm的膠體金溶液，葡萄球菌A蛋白（SPA），制備免疫膠體金復(fù)合物，組裝膠體金免疫層析快速診斷試紙條。結(jié)果用檸檬酸還原法制備的20nm膠體金溶液呈亮紅色。膠體金標(biāo)記SPA的最低穩(wěn)定濃度5pg/ml,最適穩(wěn)定量為6pg/ml。SPA標(biāo)記的最適pH為6.0。以此試紙條檢測(cè)臨床血清標(biāo)本與進(jìn)口ELISA試劑盒比較，組間陽性率比較差異無顯著性。結(jié)論膠體金免疫層析試紙條質(zhì)量穩(wěn)定性不但與抗原抗體的選擇、用量?jī)?yōu)化、層析材料的選擇、膠體金的制備與標(biāo)記等因素密切相關(guān)，而且緩沖系統(tǒng)的優(yōu)化、輔助添加劑的選擇與優(yōu)化組合也非常重要。【關(guān)鍵詞】幽門螺桿菌；膠體金；免疫層析檢測(cè)ResearchondevelopmentofgoldimmunochromatographictestkitforserumH.pyloriantibodyIgG【Abstract】ObjectiveDevelopinggoldimmunochromatographictestkitforserumH.pyloriantibodyIgGandoptimizethekeyexperimentconditions.MethodsPreparingthecolloidgoldparticlesof20nmwhichwerecoupledwithStreptococcusproteinA(SPA)，setupthegoldimmunochromatographytestkitforserumH.pyloriantibodyIgG.ResultsThespheroidalcolloidgoldparticlesof20nmisshownincolorofbrightred.Theminimalstableconcentration(MSC)ofgold-SPAis5pg/ml,andthesuitablestableconcentration(SSC)is6pg/ml.ThepH6.0isappropriate.53serasamplesweretestedbyGICAandELISA，thereisonsignificantdifferencebetweentwomethods.ConclusionThequalityofgoldimmunochromatographytestkitisassociatedwiththefactors，suchasthequalityandquantityofantigenorantibody，colloidgoldparticles，buffers，etc.【Keywords】helicobacterpylori;colloidgold;goldimmunochromatographicassay在幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp)感染的診斷中，細(xì)菌培養(yǎng)、組織病理學(xué)檢查、尿素酶試驗(yàn)、呼氣試驗(yàn)等方法或因?yàn)榻o患者造成的侵入性痛苦，或需要一定的條件和技術(shù)，或因?yàn)樾枰厥鈨x器，或因?yàn)橘M(fèi)用昂貴等，其臨床推廣及多次重復(fù)追蹤復(fù)查受到限制。而血清學(xué)檢測(cè)因其非侵入性、快速、準(zhǔn)確，可同時(shí)處理大量標(biāo)本，檢測(cè)不同類型的抗體，在臨床檢驗(yàn)、基礎(chǔ)研究中倍受青睞。20世紀(jì)80年代興起的膠體金免疫層析檢測(cè)(goldimmunochromagraphyassay,GICA)，操作簡(jiǎn)單快捷、結(jié)果清晰易于判斷、無需復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)技能和特殊設(shè)備，特別適于基層衛(wèi)生單位使用。本研究預(yù)采用H.pylori超聲全菌體抗原、葡萄球菌A蛋白(SPA)抗原，嘗試研制一種根據(jù)雙抗原夾心法檢測(cè)原理檢測(cè)血清、唾液中抗H.pylori的IgG抗體的膠體金免疫層析檢測(cè)試劑，優(yōu)化膠體金免疫層析快速診斷試紙條研制各關(guān)鍵步驟的實(shí)驗(yàn)條件，為進(jìn)一步研制和開發(fā)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。材料與方法1.1材料幽門螺桿菌菌種SS1為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物與流行病研究所保存；TSB肉湯(Trypticsoybroth)為DIFCO公司產(chǎn)品；氯金酸(HAuCl4.H2O)，上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品；檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7.2H2O)，北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司產(chǎn)品；葡萄球菌A蛋白(SPA)、牛血清白蛋白(BSA)，均為Sigma公司產(chǎn)品；聚乙二醇(PEG20000)，F(xiàn)LUKA公司產(chǎn)品;以上試劑均為分析純。厭氧培養(yǎng)罐AnaeroPackRectangularJar為三菱化學(xué)公司產(chǎn)品。1.2方法1.2.1玻璃器皿的清潔制備膠體金的所用容器均應(yīng)反復(fù)清洗，并硅化處理玻璃容器的內(nèi)表面，最后用MQ超純水沖洗晾干備用。1.2.2膠體金顆粒的制備取1%氯金酸溶液1ml，加99ml超純水成終濃度0.01%的氯金酸溶液，加熱沸騰后，取1%檸檬酸三鈉1.6ml—次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，繼續(xù)加熱至溶液由淡黃色轉(zhuǎn)為藍(lán)黑色最終變?yōu)榱良t色，顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱5min，室溫冷卻，補(bǔ)充失水至原體積。1.2.3免疫膠體金復(fù)合物的制備膠體金標(biāo)記蛋白最低穩(wěn)定濃度與最適穩(wěn)定量的確定目測(cè)法確定膠體金與待標(biāo)記蛋白質(zhì)用量比例：用0.1mol/L的碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH至5.9?6.2,取11支潔凈試管分裝膠體金溶液(1ml/管)。將待標(biāo)記蛋白質(zhì)SPA逐級(jí)稀釋后(由2?10旳另設(shè)對(duì)照管），各取等體積順序加入一系列裝有1ml膠體金的試管中，混勻；5min后，在上述各管內(nèi)分別加入10%氯化鈉溶液0.1ml，混勻，室溫靜置。依表1順序進(jìn)行。表1膠體金標(biāo)記SPA的最低穩(wěn)定濃度實(shí)驗(yàn)（略）（1）室溫靜置2h以上觀察結(jié)果；⑵未加SPA的11號(hào)管為對(duì)照管；1號(hào)管既不加SPA也不加氯化鈉溶液同樣設(shè)為對(duì)照；⑶未加蛋白及加入蛋白量不足以穩(wěn)定膠體金的試管，即呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象，而加入蛋白量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量的試管則保持膠體金的紅色不變。以此使膠體金紅色不變而蛋白質(zhì)含量最低的試管的蛋白量，即為穩(wěn)定1ml膠體金的必需蛋白量，也即最低穩(wěn)定量。在此基礎(chǔ)上再加20%即為穩(wěn)定1ml膠體金所需蛋白質(zhì)的實(shí)際最適用量。最適標(biāo)記pH的確定調(diào)節(jié)膠體金溶液pH依次為4、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，配合上述最低穩(wěn)定量實(shí)驗(yàn)，確定標(biāo)記蛋白的最佳標(biāo)記pH。SPA標(biāo)記膠體金當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的最適穩(wěn)定量及標(biāo)記的最佳pH值被確定以后便可進(jìn)行標(biāo)記。具體步驟如下：按最低穩(wěn)定量的120%計(jì)算出所需待標(biāo)記蛋白質(zhì)的總量。在磁力攪拌下，將蛋白質(zhì)溶液加入膠體金溶液中（pH已調(diào)至5.9?6.2），加入蛋白質(zhì)時(shí)應(yīng)逐滴加入，1mg的蛋白質(zhì)大約5min加完。分別取1ml膠體金-SPA結(jié)合物液（實(shí)驗(yàn)組）和1ml膠體金原液（對(duì)照組）于試管中加10%氯化鈉溶液0.1ml，室溫靜置1h，觀察結(jié)果：如果對(duì)照組試管溶液由紅色轉(zhuǎn)為藍(lán)色，甚至可以看到聚合物沉淀，而實(shí)驗(yàn)組溶液仍保持紅色，無沉淀，方可繼續(xù)下一步實(shí)驗(yàn)，否則需補(bǔ)加標(biāo)記用蛋白SPA。最后加入終濃度為0.2%的聚乙二醇（PEGMW20000），繼續(xù)攪拌30min。1.2.4膠體金標(biāo)記SPA復(fù)合物的純化超速離心法純化免疫膠體金復(fù)合物。先以3500rpm離心20min（4弋），棄沉淀將上清以13500rpm離心35min（平C）,棄上清，用保存液懸起較疏松的紅色沉積物；再以11000rpm離心35min（4C）,小心移棄上清后，用保存液懸起較疏松的紅色沉積物至原體積1/10，即為初步純化的免疫膠體金復(fù)合物。1.2.5膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)的檢定定量測(cè)定：以保存液作對(duì)照測(cè)530nm處OD值，4弋避光保存。質(zhì)量鑒定：用有Formvar膜的鎳網(wǎng)沾取金標(biāo)蛋白溶液，空氣中干燥后醋酸鈾負(fù)染，在TecnailO透射電鏡下觀察。1.2.6金標(biāo)墊的制備免疫膠體金復(fù)合物稀釋度的確定純化的膠體金標(biāo)記SPA作不同程度稀釋后，均勻等量浸于同樣大小的玻璃纖維素膜制成金標(biāo)墊。組裝試紙條，在其他條件不變的情況下，根據(jù)反應(yīng)結(jié)果，確定達(dá)到試紙條敏感度要求的最適膠體金標(biāo)記SPA的稀釋度，或稱為工作濃度。金標(biāo)墊的制備保存液稀釋膠體金標(biāo)記SPA復(fù)合物原液至工作濃度，按比例均勻浸于玻璃纖維素膜，-20弋凍存，冷凍真空干燥后，密封保存。H.pylori全菌超聲粉碎抗原的制備[1]幽門螺桿菌SS1采用TSB固體斜面培養(yǎng)基微需氧（5%O2、10%CO2、85%N2）37°C培養(yǎng)，72h后轉(zhuǎn)種TSB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)60h后收集菌體。H.pylori菌體用小體積生理鹽水懸浮，冰浴條件下超聲粉碎有效時(shí)間5min（150W）,超聲粉碎置顯微鏡下觀察呈均勻細(xì)顆粒狀；4C,12000r/min離心20min，收集上清；細(xì)菌沉渣再重復(fù)超聲5min，重復(fù)離心過程取上清；合并2次上清，于0.01mol/L的PB緩沖液（pH7.2）中透析24h，中間換液3次，最后12000r/min離心20min，上清測(cè)蛋白濃度后分裝，于-20C保存。H.pylori配體固相硝酸纖維素膜的制備H.pylor抗原室溫融化后，12000r/min離心10min，取上清2mg/ml用0.01mol/L的PB緩沖液（pH7.2）以250pg/ml間隔，經(jīng)BIO-DOT型XYZ3000點(diǎn)樣儀dispenser線形包被于硝酸纖維素膜的觀察結(jié)果的測(cè)試反應(yīng)區(qū)，定義為檢測(cè)帶（T）,距離檢測(cè)帶5mm遠(yuǎn)的質(zhì)控帶（C）用dispenser線形包被正常兔IgG（2mg/ml）°37°C干燥2h,4C密封保存。樣品墊的處理選擇適當(dāng)?shù)姆忾]試劑、表面活性劑和（或）非離子型去污劑單獨(dú)或以適當(dāng)比例組合后均勻浸于玻璃纖維素膜，室溫干燥備用。試紙條組裝根據(jù)功能不同可將試紙條分為四個(gè)部分：上段（A區(qū)）為手持部位（吸水濾紙：吸收檢測(cè)樣品中多余液體），中段（B區(qū)）為實(shí)驗(yàn)反應(yīng)區(qū)（硝酸纖維素膜：包括判讀結(jié)果的檢測(cè)帶T和指示試紙條質(zhì)量的質(zhì)控帶C），下段（D區(qū)）為樣品區(qū)（玻璃纖維素膜：接觸待檢測(cè)樣品），在中下段之間（C區(qū)）放置浸有膠體金標(biāo)記SPA復(fù)合物的金標(biāo)墊；而整個(gè)試紙條貼附于雙面膠白色塑料背板（見圖1）。1.3臨床血清標(biāo)本H.pylor抗體IgG檢測(cè)取1998年3月?2001年9月期間在我院消化門診就診，臨床診斷為幽門螺桿菌胃炎患兒血清53份。加入80pl于試紙條樣品區(qū)，2?5min開始觀察結(jié)果，20min觀察終止。出現(xiàn)1條紅色（對(duì)照）沉淀線，為血清學(xué)診斷陰性；出現(xiàn)2條紅色（樣品和對(duì)照）沉淀線，為血清學(xué)診斷陽性。同時(shí)采用華美生物工程公司ELISA試劑盒對(duì)血清標(biāo)本進(jìn)行對(duì)照檢測(cè)。組間陽性率采用U檢驗(yàn)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1膠體金顆粒制備我們實(shí)驗(yàn)所用檸檬酸還原法制備的20nm膠體金溶液呈亮紅色，用預(yù)先處理好的覆有Formvar膜的鎳網(wǎng)浸膠體金后在透射電鏡下觀察，可見金顆粒大小基本一致，分布均勻，圓形（圖2）。測(cè)量100個(gè)膠體金顆粒直徑，計(jì)算平均直徑約20nm。2.2膠體金標(biāo)記SPA的最低穩(wěn)定濃度、最適穩(wěn)定量及最適pH加入不同濃度SPA的膠體金溶液在加入氯化鈉后呈現(xiàn)不同顏色（由藍(lán)色伴聚合物沉淀逐漸過渡到亮紅色），使膠體金溶液紅色不變而蛋白質(zhì)含量最低的試管中加入5pgSPA,因此確定本次制備的20nm膠體金標(biāo)記SPA的最低穩(wěn)定量是每毫升膠體金溶液5pgSPA,最適穩(wěn)定量為每毫升膠體金溶液6pgSPA。膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合成功與否，取決于pH值，一般只有在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（PI）略偏堿的條件下二者才能牢固地結(jié)合，實(shí)驗(yàn)證實(shí)SPA標(biāo)記的最適pH為6.0，符合理論預(yù)測(cè)。2.3膠體金標(biāo)記SPA復(fù)合物的制備與純化將膠體金溶液pH值調(diào)至6.0，30ml膠體金溶液在磁力攪拌下緩緩加入180訓(xùn)SPA溶液（1mg/ml）,加入PEG20000增加膠體金溶液的穩(wěn)定性，超速離心純化后在Tecnai10透射電鏡下觀察，可見金顆粒外圍有明顯的低電子密度暈圈，表明金顆粒表面吸附有蛋白（圖3）2.4臨床血清標(biāo)本H.pylor抗體IgG檢測(cè)結(jié)果53份受檢血清中抗Hp血清抗體IgG膠體金法陽性21份，疑似7份，陰性25份；ELISA法陽性19份，疑似6份，陰性28份。組間陽性率比較差異無顯著性（U檢驗(yàn)，P>0.05）。表3兩種方法檢測(cè)臨床血清標(biāo)本H.pylor抗體IgG結(jié)果比較（略）討論膠體金標(biāo)記技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物或顯色劑，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)，現(xiàn)在已成功用于電鏡、流式細(xì)胞儀、免疫印跡、蛋白染色、體外診斷制劑的制造等領(lǐng)域。膠體金的制備并不難，但要制備高質(zhì)量的膠體金卻并非易事，通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)我們總結(jié)出如下經(jīng)驗(yàn)：（1）所用化學(xué)試劑應(yīng)為分析純?cè)噭?，試劑質(zhì)量直接影響膠體金制備的成功與否；（2）配制溶液用水應(yīng)為雙蒸水或MQ超純水，而且必須注意到不同來源的水其pH和離子強(qiáng)度有很大差異；（3）玻璃器皿的清潔是非常關(guān)鍵的一步。如果玻璃器皿內(nèi)不干凈或者有灰塵落入就會(huì)干擾膠體金顆粒的生成，形成的顆