高效液相色譜-串聯質譜法測定人血清中5種抗真菌藥物及相關代謝產物的測量方法

背景介紹近年來隨著醫(yī)學技術的不斷發(fā)展，器官移植、骨髓移植、重癥感染的患者逐年增多，發(fā)生侵襲性真菌感染和抗菌藥物的耐藥率迅速上升，唑類抗真菌藥物成為臨床應用最廣泛的抗菌藥物之一。但一些抗真菌藥物在個體內和個體間存在較大的個體變異，在治療過程中患者體內的藥物濃度可能會“因人而異”，因此對其進行血藥濃度監(jiān)測具有臨床意義。本文闡述了一種能夠同時檢測多種抗真菌藥物的方法，能夠幫助臨床準確定量患者體內的抗真菌藥物濃度，避免出現用藥不足或用藥過量而導致的副反應。文章亮點01.建立了一種LC-MS/MS法檢測人血清中5種抗真菌藥物及2種代謝產物的血藥濃度的方法；02.對該方法進行了性能驗證，該方法準確度好，精密度高，基質效應?。?3.研究了一種能夠使多種抗真菌藥物穩(wěn)定的基質配方，病毒和微生物感染風險小，為實現臨床檢測提供基礎。內容介紹1實驗部分1.1

主要儀器與試劑1.2

樣品前處理1.3

分析方法1.4

溶液的配制標準儲備液的配制：準確稱取適量VRC、VNO、PCZ、ICZ、HICZ、FCZ、CPF標準品，用甲醇分別溶解并配制成濃度為1mg/mL的標準儲備液。分別移取不同體積的儲備液于同一容量瓶中，配制成混合標準溶液。儲備液于-80℃冰箱中保存，混合標準溶液于-20℃冰箱中保存。1.5

定量方法采用空白基質加標做曲線，同位素內標法定量，樣本與基質匹配標準品、質控物樣本一同處理后進樣，用儀器自帶軟件繪制標準曲線并定量。2結果與討論2.1

樣品前處理方法的建立通過對血液樣本進行蛋白沉淀后，并對上清液進行稀釋。稀釋后能夠減少樣品中雜質成分進入檢測器對分析物產生干擾，同時減少基質效應的產生，但稀釋液的種類影響目標分析物的穩(wěn)定性。2.2

液相方法的建立為了改善分離度和峰形，本方法通過改變流動相的pH來改善。采用5mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸的水溶液為流動相A，0.1%的甲酸乙腈溶液為流動相B，添加乙酸銨是為了增加響應較低的伊曲康唑和羥基伊曲康唑的靈敏度；選擇添加甲酸，是為了改善卡泊芬凈的色譜峰形，在A相和B相中同時添加同濃度的甲酸，是為了保證在A相和B相任意比例混合時，始終保證體系在相同的酸堿度下進行分離，色譜分析更穩(wěn)定。圖2中a為流動相中未加酸的卡泊芬凈的色譜峰，b為流動相中添加甲酸后的卡泊芬凈的色譜峰，由圖可知，添加甲酸可改善卡泊芬凈的峰形。2.3

基質匹配標準品和質控物基質的考察由于基質的添加，標準品和質控物的穩(wěn)定性存在一定問題，圖4為不加任何穩(wěn)定劑的兩種濃度的標準品加速結果，伏立康唑氮氧化物、伊曲康唑等響應降低。2.4

相對基質效應考察基質效應是指基質成分和目標化合物在進行離子化時，因相互競爭而導致目標化合物信號強度有不同程度增強或減弱的現象。標準曲線和分析物的基質不同時，應該進行基質效應評估。因此，評估基質效應是LC-MS方法驗證的關鍵組成部分[18]。采用混合實驗的方法，對本方法的相對基質效應進行評估。2.5

線性考察通過向空白人血清中添加一定濃度的混合標準溶液制成低值樣本S1和高值樣本S7，將S1和S7按不同比例混合配制成線性樣本S2~S6。每個濃度點按照1.2方法重復測定3次，分別得出每個濃度點測定結果的均值，以稀釋濃度為自變量，以測定結果均值為因變量求出多項式回歸方程，計算相關系數R2。2.6

準確度考察通過向已知濃度人血清樣本中添加混合標準溶液，測定加標回收率，來評估方法的準確度。2.7

精密度考察通過向空白人血清樣本中添加混合標準溶液，配制成低、中、高3個濃度的精密度樣本，每個濃度制備5個平行樣，按照1.2方法測定，考察批內精密度，上述樣本重復制作并測定3d，考察批間精密度。結果表明，本方法有良好的精密度。3結論本文建立了一種能夠同時檢測人血清中5種抗真菌藥物及其代謝產物的HPLC-MS/MS方法，方法簡便，以同位素為內標，準確度高，基質匹配標