如何精準(zhǔn)把握細(xì)胞消化時間

如何精準(zhǔn)把握細(xì)胞消化時間？在貼壁細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞消化是至關(guān)重要的步驟，可以說直接影響后續(xù)實驗的成敗。消化時間過長過短都會導(dǎo)致細(xì)胞受到損傷，進(jìn)而出現(xiàn)細(xì)胞生長速度減慢，大量漂浮不貼壁，拉絲、空泡等異常形態(tài)，甚至細(xì)胞死亡的情況。因此把握最佳消化時間是培養(yǎng)細(xì)胞的必修課之一。一、了解細(xì)胞貼壁強弱首先，了解細(xì)胞的貼壁的強弱是判斷最佳消化時間的基礎(chǔ)。不同種類的細(xì)胞在貼壁強度是有差異的，如果你對你將要培養(yǎng)的細(xì)胞并不了解，可以先去ATCC、上海中科院細(xì)胞庫等權(quán)威細(xì)胞庫查看消化時間，作為我們的預(yù)期消化時間。二、消化試劑的配方、品牌將影響消化時間以最常用的胰蛋白酶為例，胰酶濃度越高消化能力越強，添加EDTA也可促進(jìn)胰酶的消化作用。另外，即使是相同配方的胰酶，因不同廠家生產(chǎn)工藝不同，消化效果也會有差異。因此實際消化時間可能與ATCC等細(xì)胞庫描述不一樣，應(yīng)該以具體情況確定。三、細(xì)胞部分脫落時即可終止消化如果你是第一次消化細(xì)胞、購買了新的細(xì)胞、或者換了消化試劑的品牌，需要摸索一次最佳消化時間，作為以后消化該細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。以下是確認(rèn)最佳消化時間的方法，以胰酶為例：1.加足量PBS潤洗細(xì)胞1-2次，清除殘留的培養(yǎng)基，潤洗的PBS也盡量吸干凈（培養(yǎng)基中的血清會抑制胰酶活性、殘余過多PBS會稀釋胰酶，均會影響消化效果）；2.將適量胰酶加入培養(yǎng)器皿，搖晃鋪勻后放入37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行消化。隨后每隔30秒拿出觀察一次，若細(xì)胞未發(fā)生脫落，則放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化。（貼壁緊的細(xì)胞可以延長時間，1-5min觀察一次，或參考權(quán)威細(xì)胞庫提供的參考時間）；3.直到顯微鏡下可見細(xì)胞間隙變大并脫落，將培養(yǎng)器皿對著燈光觀察，肉眼可見部分細(xì)胞開始滑落，說明消化完成，可以加入完全培養(yǎng)基進(jìn)行中和（注意貼壁較緊的細(xì)胞建議先吸取正在消化的胰酶輕輕吹下細(xì)胞，再加終止液）。四、值得注意的細(xì)節(jié)細(xì)胞變圓但未脫落時建議繼續(xù)消化，此時吹打細(xì)胞可能會導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，所以建議細(xì)胞能滑落再終止消化，確保細(xì)胞是被胰酶消化下來而不是被強行吹下的。強行吹下細(xì)胞的損傷比胰酶對細(xì)胞的損傷大得多，大部分細(xì)胞系對胰酶有一定耐受性，遇到消化不下來的情況可以適當(dāng)延長時間。PBS僅潤洗一次可能還